目的:铁是机体必需的金属离子之一,参与体内多种生物代谢过程,发挥重要作用。脑铁属于非血红素铁,在脑内分布广泛,其稳态平衡受到严格调控。研究表明,脑铁含量与年龄呈正相关。随年龄增加,脑铁含量增加。而某些神经退行性疾病如阿尔茨海默病患者脑内亦出现铁超载或铁离子异常聚集。实验证明,细胞内铁含量过高可引起氧化应激增强、蛋白质聚集乃至细胞死亡;而AD发病的诸多病因中,铁、锌、铜等金属离子与APP表达、Aβ分泌和沉积密切相关。可见维持脑铁稳态平衡至关重要。但迄今为止,脑铁的具体调控机制尚不明确。Ndfip1是一种进化保守的跨膜蛋白,能够与Nedd4家族特异结合,参与某些蛋白的泛素化降解过程。Ndfip1的功能是作为一种衔接蛋白,通过其氨基端的两个PPXY基序与E3泛素连接酶Nedd4家族的WW域连接,并招募靶蛋白,最终导致靶蛋白多聚泛素化并被蛋白酶体识别和降解。有研究显示,Ndfip1与铁离子的稳态平衡有关,可参与调控细胞内铁离子的转运过程。DMT1是一种二价金属离子转运体,介导铁离子转入细胞内。有实验证实Ndfip1与DMT1存在相关性,在神经细胞内两者均表达,在胞浆呈点状分布,且共定位于高尔基复合体。Ndfip1可负性调控DMT1的表达和转运功能,其作用机制是通过泛素—蛋白酶体降解途径实现的,蛋白酶体抑制剂MG132可抑制Ndfip1对DMT1的负性调控作用。由此推测,Ndfip1通过调控DMT1的表达和活性,进而调节细胞内铁离子浓度,减轻铁离子对神经细胞造成的损伤,最终发挥其神经保护作用。为了深入研究Ndfip1对脑铁代谢的调控作用和调控机制,我们首先对Ndfip1在小鼠脑内皮质和海马的定位分布和表达进行系统的观察和定量检测,并观察年龄因素对Ndfip1表达水平的影响。随后,我们检测了Ndfip1在阿尔茨海默病小鼠模型（APP/PS1转基因小鼠）和细胞模型（稳定转染人APP基因的SH-SY5Y细胞）中的表达变化,以期寻找Ndfip1参与AD脑内铁离子代谢的实验证据。最后,我们以过表达Ndfip1的APPsw细胞为模型检测APP代谢产物,DMT1蛋白表达水平、细胞转铁能力及细胞生存率的变化,为探讨Ndfip1参与阿尔茨海默病脑铁代谢的作用机制提供理论依据。研究方法:应用免疫组化、免疫荧光、Western Blot和RT-PCR技术对Ndfip1在C57BL/6小鼠脑内皮质和海马的定位分布和表达进行系统的观察和定量检测。应用Western Blot技术检测不同年龄阶段Ndfip1、DMT1表达规律,寻找两者的相关性。应用免疫组化、免疫荧光三标共聚焦激光扫描技术、Western Blot和RT-PCR技术对Ndfip1在APP/PS1转基因小鼠的皮质和海马以及稳定转染人APP基因的SH-SY5Y细胞（APPsw细胞）的定位分布和表达变化进行检测。构建Ndfip1真核过表达质粒,转染APPsw细胞。Western Blot法检测转染24 h、48 h和72 h后Ndfip1蛋白水平表达变化,以确定质粒的转染效率。Western Blot法和ELISA法检测Ndfip1质粒转染APPsw细胞后APP代谢及DMT1蛋白水平表达变化。应用钙黄绿素荧光淬灭法,通过荧光显微镜观察和荧光分光光度计定量检测Ndfip1质粒转染APPsw细胞在铁超载条件下荧光强度变化,分析DMT1转运铁能力的改变。MTT法检测0~500μmol/L的FeSO4和FeCl3对APPsw细胞生存率的影响及Ndfip1过表达对200μmol/L FeSO4或FeCl3引起的APPsw细胞生存率降低的影响。结果:1、Ndfip1在小鼠大脑皮质和海马的表达及增龄性改变:Ndfip1在成年小鼠大脑皮质分布广泛;在海马局限表达于CA3区,在CA1、CA2和DG均未见阳性细胞。Ndfip1定位表达于大脑皮质和海马的锥体细胞的胞体和突起内。Western Blot结果显示Ndfip1在小鼠大脑皮质和海马均有表达,在皮质的蛋白含量多于海马。RT-PCR结果显示Ndfip1 mRNA在小鼠大脑皮质和海马均有表达,且在皮质的表达量与海马相比无显著性差异。Western Blot结果显示生后1、4、12、24、36、48周小鼠大脑皮质和海马中均有Ndfip1蛋白表达,其表达变化与年龄具有一定相关性。成年小鼠,特别是接近老年的小鼠,脑内Ndfip1表达量明显低于刚出生1周的小鼠。Western Blot结果显示生后1、4、12、24、36、48周小鼠大脑皮质和海马中均有DMT1-IRE和DMT1-nonIRE蛋白表达,其表达变化与年龄具有一定相关性。成年小鼠,特别是接近老年的小鼠,脑内DMT1-IRE和DMT1-nonIRE表达水平比新生1周小鼠高。随着年龄的增长,小鼠皮质、海马内DMT1-IRE、DMT1-nonIRE表达变化规律与Ndfip1正好相反。2、Ndfip1在阿尔茨海默病小鼠模型和细胞模型的表达:在APP/PS1转基因小鼠皮质、海马可见Ndfip1阳性表达。Ndfip1在皮质分布较为广泛;在海马,局限表达于CA3区。大部分Ndfip1阳性表达位于锥体神经元的胞质和突起中。有趣的是,老年斑部位特别是中央区域亦可见Ndfip1的阳性表达。APP/PS1转基因小鼠皮质、海马内Ndfip1蛋白表达水平低于对照组。APP/PS1转基因小鼠大脑皮质和海马内Ndfip1 mRNA表达水平与野生型对照组相比无显著性差异。在AD细胞模型中,Ndfip1分布于细胞胞质;其蛋白含量低于对照组。体外实验结果与在体研究结果基本相近。3、Ndfip1通过调控DMT1表达和活性,影响APP代谢过程,减弱铁离子对细胞的毒性作用:Ndfip1真核过表达质粒经PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳分离检测和测序比对,结果证实Ndfip1真核过表达质粒构建成功。Western Blot检测显示Ndfip1质粒转染APPsw细胞后,Ndfip1蛋白水平上调。转染24h和48 h后Ndfip1表达量与对照组相比分别增加了40%和66%。Western Blot检测Ndfip1转染48 h后APPsw细胞内的APP695表达量与转空载体的APPsw细胞相比明显下调。Western Blot检测Ndfip1转染48 h后APPsw细胞内DMT1-IRE,DMT1-nonIRE表达量与转空载体的APPsw细胞相比明显下调。Western Blot检测Ndfip1转染48 h后APPsw细胞分泌的Aβ1-42减少。应用钙黄绿素荧光淬灭法,荧光显微镜观察发现Ndfip1转染细胞质内的荧光强度强于转空载体细胞。应用钙黄绿素荧光淬灭法,荧光分光光度计检测发现Ndfip1转染细胞的荧光淬灭速度减慢。MTT法检测了0~500μmol/L的FeSO4和FeCl3对细胞生存率的影响,FeSO4和FeCl3的浓度为200μmol/L时,APPsw细胞生存率下降了20%。Ndfip1过表达可以减轻200μmol/L FeSO4或FeCl3引起的APPsw细胞生存率降低。结论:1、Ndfip1在C57BL/6小鼠大脑皮质和海马CA3区分布表达。锥体细胞的胞体和突起可见Ndfip1阳性表达,细胞核内未见表达。2、随着年龄增长,Ndfip1和DMT1在C57BL/6小鼠大脑皮质和海马的表达发生变化,说明年龄是影响Ndfip1和DMT1蛋白表达的因素之一;而两者的变化规律正好相反,提示Ndfip1对DMT1的表达变化具有一定的调控作用。3、APP/PS1转基因小鼠皮质、海马Ndfip1表达下调。4、APP/PS1转基因小鼠大脑皮质和海马老年斑的中心部位可见Ndfip1的阳性表达。5、APPsw细胞Ndfip1表达下调。6、Ndfip1真核质粒转染能够增加APPsw细胞Ndfip1目的基因的蛋白表达,可将其作为探讨Ndfip1功能的细胞模型。7、Ndfip1能够下调APPsw细胞APP695表达,减少Aβ1-42分泌。8、Ndfip1能够下调APPsw细胞DMT1的表达和转铁能力。9、Ndfip1能够减轻过量铁离子导致的APPsw细胞生存率的降低,发挥保护神经细胞的作用。