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蓝舌病是由蓝舌病病毒引起、侵害绵羊和牛等家畜、以高热、白细胞减少、黏膜溃疡性炎症变化等为主要症状的反刍动物传染病。该病是由库蠓等昆虫媒介传播的非接触性传染病,纯种细毛羊为最易感动物,平均死亡率为35%,最高可达80%。BTV血清型多达26个,且互相之间无有效保护作用。该病流行范围广,传播速度快,2006年前BTV4在希腊、西班牙、法国、葡萄牙等国大面积流行;2006年后BTV8在欧洲多国大规模爆发,造成了极大的经济损失。BTV分为10个节段,主要编码7种结构蛋白(VP1~VP7)和4种非结构蛋白(NS1、NS2、NS3/NS3a和NS4)。VP7蛋白是一组特定的蛋白质的BTV,S7基因编码349个氨基酸,位于病毒的核衣壳表面,不同血清型的VP7蛋白超过94%保守的氨基酸之间;VP2蛋白是BTV的型特异性蛋白,由L2基因编码,大小范围在950到960个氨基酸之间,位于病毒外层衣壳,各血清型之间氨基酸序列变化范围在22.7%到72.9%之间。本研究对8型及4型VP2蛋白和8型BTV的VP7蛋白进行原核表达,制备在此基础上的单克抗隆体,为后期建立血清学诊断方法提供物质基础,为口岸检疫和防止新血清型流入我国提供技术储备。根据Gen Bank中公布的BTV8 S7基因、BTV4 L2基因和BTV8 L2基因序列合成基因,设计引物将BTV4和BTV8的L2基因各分为4A、4B、4C和8A、8B、8C三段,进行原核表达。分别将S7基因和L2分段基因克隆到原核表达载体p ET-28a(His标签)和p MAL-c5x(MBP标签)中构建重组质粒。对转化到感受态细胞B21中阳性质粒1.0mmol/L的IPTG对其进行表达。通过检测,重组蛋白His-VP7、His-4A、His-4B、His-4C、His-8A、His-8B、His-8C和MBP-VP7、MBP-4A、MBP-4B、MBP-4C、MBP-8A、MBP-8B、MBP-8C均已获得表达。对带有MBP标签的重组蛋白通过直链淀粉树脂进行纯化,带有His标签的重组蛋白用切胶纯化的方法进行纯化。以带有His标签的VP7和VP2蛋免白疫BALB/c小鼠,利用体细外胞合融技术将免疫后小鼠的细脾胞与SP2/0骨瘤髓细胞进行细胞融合。以带有MBP标签的重组纯化后蛋白,创建间接ELISA方法对杂交瘤细胞进行选择性培养。共获得了5株交杂瘤细能胞定稳泌分抗BTV8VP7蛋单白抗体,依次为3D7、6B5、5C9、6D11和3F4;获得3株定稳分抗泌BTV4 VP2蛋白克单隆抗体的杂瘤交细胞1G7、8G3、5E6和2株稳分定泌抗BTV8 VP2蛋克白单隆抗体的杂瘤交细胞2B8、3G11。Western blot证实所获得单隆体均能与蛋白应发重的生相组特异性反应,应反性原较好。间接免疫荧光试验和间接ELISA试验结果表明,单抗3F4与BTV4发生特异性反应,与茨城病病毒、赤羽病病毒、猪轮状病毒不发生交叉反应。经抗体亚类鉴定试剂盒鉴定,抗BTV8 VP7蛋白的单克隆抗体中,3D7、3F4、5C9、6D11的亚类均为Ig G1,6B5的亚类为Ig M;抗BTV4 VP2蛋白的单克隆抗体中,1G7、8G3的亚类为Ig G1,5E6的亚类为Ig G2b;对BTV8 VP2蛋白的单克隆抗体3G11,2B8是Ig G2b亚型。