研究目的众所周知,脑缺血再灌注后会造成脑部特定区域的神经细胞损伤,然而这种损伤机制尚不清楚。前期我们课题组的实验研究表明,左旋樟脑能够保护脑缺血再灌注损伤,然而,对于这种保护机制的研究还很少。有研究表明,脑缺血再灌注可能会导致神经细胞突起损伤,而缺血损伤和坏死物质的刺激会致使自噬、凋亡过度激活,使得细胞内容物降解过多引发细胞死亡,导致组织器官严重损伤。保护神经细胞突起以及抑制凋亡与自噬过度激活可能作为一种新的缺血性脑损伤的干预靶点,成为脑缺血再灌注基础研究与潜在临床应用的新热点。本课题主要研究左旋樟脑对脑缺血再灌注损伤的机制,初步探讨左旋樟脑在脑缺血损伤中的保护作用。前期课题组有实验证明左旋樟脑保护神经细胞是通过抑制凋亡效应、抑制脑缺血再灌注损伤后自噬的过度激活,其机制可能是作用于GABAA受体靶向P53影响机体。还证明部分MicroRNA通过调控其靶基因参与中枢神经系统的发育和功能维持,左旋樟脑、MicroRNA等可能在脑缺血再灌注后的病理生理过程中扮演着某种重要角色。实验方法1.运用大鼠右侧颈动脉插线制备脑缺血动物模型,造模后对大鼠进行神经功能性评分。并观察左旋樟脑作用24h能否影响脑缺血再灌注动物模型的神经功能性评分。再断头取脑,取新鲜的大鼠皮质,进行MiroRNA基因芯片分析。依据基因芯片分析结果挑选miR-125a等作为研究对象,qRT-PCR检测miR-125a等在左旋樟脑作用下的表达情况。2.在生物信息学软件上预测miR-125a可能存在的相关靶点,构建特异性表达的rno-miR-125a-3p模拟物和抑制物,转染进PC12细胞,经免疫荧光检测观察相关靶蛋白表达情况,与正常组、模型组相比,检测miR-125a是否与蛋白Cadm2的表达相关。3.转染特异性表达的rno-miR-125a-3p模拟物和抑制物以及相应的阴性对照物进入PC12细胞后,经Western Blot进行功能性验证;通过构建靶基因-3’ UTR区含rno-miR-125a-3p的结合位点的双荧光素酶报告基因进一步验证Cadm2和miR-125a的关系。4.转染特异性表达的rno-miR-l25a-3p模拟物和抑制物以及相应的阴性对照物至PC12细胞,经ImagJ检测miR-125a-3p与PC12细胞的梭形细胞比率,分化率以及平均长度之间是否存在关联。5.rno-miR-125a-3p模拟物和抑制物以及阴性对照物转染至PC12细胞后,无血清处理的同时加入左旋樟脑,采用Western blot法检测凋亡相关蛋白(caspase-3)和自噬相关蛋白(LC3、P62)表达情况。实验结果1.本实验在脑缺血再灌注动物模型基础上,在给药前后进行行为学评分。结果发现左旋樟脑能降低脑缺血再灌注损伤动物模型的行为学评分。取新鲜皮质进行基因芯片分析,结果显示,与对照组相比,模型组中miR-125a的表达升高明显。qRT-PCR结果显示,与模型组相比,左旋樟脑能抑制脑缺血再灌注动物模型中的miR-125a表达,且P<0.05具有统计学意义。2.生物信息学预测miR-125a的潜在靶点可能是Cadm2。转染后免疫荧光测结果显示,与对照组、模型组相比,miR-125a模拟物组中Cadm2的表达下降,抑制物组中Cadm2的表达上升(P<0.05具有统计学意义)。3.经Western Blot和报告基因验证,实验结果显示,与正常组以及阴性对照组比,模拟物组中的Cadm2的表达下降,抑制物组中Cadm2上升明显且P<0.05具有统计学意义;报告基因验证验证的结果也与Western Blot实验结果相验证。4.ImagJ检测PC12细胞的梭形细胞比率,分化率以及平均长度,发现与正常组以及阴性对照组比,miR-125a模拟物组的各指标都受到抑制,而抑制物组中各组指标都有上升(P<0.05具有统计学意义)。5.rno-miR-125a-3p模拟物能抑制血清饥饿诱导下Cadm2和P62的表达,促进caspase-3和LC3表达;而左旋樟脑和rno-miR-125a-3p抑制物能促进血清饥饿诱导下Cadm2及P62的表达,抑制caspase-3和LC3表达,而当左旋樟脑与rno-miR-125a-3p抑制物合用时,上述结果更为明显(P<0.05具有统计学意义)。结论在缺血性再灌注动物模型以及细胞实验当中我们发现,左旋樟脑能通过调控miR-125a靶向Cadm2对脑缺血再灌注损伤的保护作用,是通过靶向抑制miR-125a的表达,使Cadm2蛋白上调保护神经突起。左旋樟脑能通过调控miR-125a抑制细胞凋亡和自噬保护脑缺血再灌注损伤,此研究为左旋樟脑在脑缺血的预防和治疗上提供理论依据。