论文部分内容阅读
目的：构建能在真核细胞中稳定表达HBD2-E7c融合基因的重组质粒,并初步研究其在BALB/c成年雌性小鼠中的免疫功能状态及细胞免疫应答,为HBD2-E7c联合基因疫苗的研究及应用奠定基础。方法：1.以pcDNA3.1(+)/E7为模板,通过PCR(聚合酶链反应)扩增基因片段E7c,经双酶切后连接到pcDNA3.1(+)载体上,构建pcDNA3.1(+)/E7c质粒,通过双酶切与DNA序列测定进行鉴定。2.委托北京英茂盛业生物科技有限公司构建pEGFP-C1/HBD2,并对其进行鉴定。3.同时用Apa I和EcoR I双酶切pcDNA3.1(+)/E7c和pEGFP-C1/HBD2,将酶切产物纯化回收,进行连接反应,构建pEGFP-C1/HBD2-E7c联合质粒,并转入感受态细胞大肠杆菌JM109中,随机挑选阳性克隆株,用酶切鉴定和DNA序列测定方法鉴定联合质粒；以脂质体转染法将联合质粒瞬时转染MCF7细胞中,荧光显微镜下观察融合基因的蛋白表达表达。4.将40只四周龄的雌性BALB/c小鼠随机分为4组,每组10只：PBS组(A组),pcDNA3.1(+)/E7c质粒(B组),空质粒pEGFP-C1(+)和pcDNA3.1(+)/E7c(C组),融合基因组即pEGFP-C1/HBD2-E7c(D组),分别按每次100ug/只进行股四头肌肌内注射,时间间隔2周、共注射3次。5.于末次免疫后1周用摘眼球采血法收集小鼠血清,剖杀小鼠后取小鼠脾脏称重,采用脾脏指数测定检测脾脏变化,收集免疫小鼠脾淋巴细胞,采用FCM方式检测淋巴细胞亚群CD4+、CD8+细胞数量及比值；以上海科肽生物科技有限公司合成的HPV16E7短肽(Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn ILe Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp)为抗原,经摸索优化条件后用间接ELISA检测小鼠E7抗体产生情况。分析小鼠免疫功能,评价联合质粒的免疫效果。结果：1.测序及酶切结果表明成功构建pcDNA3.1(+)/E7c及pEGFP-C1/HBD2-E7c联合质粒,基因序列与设计序列一致、基因位点无突变与表达框架移位。转染MCF7细胞后荧光显微镜下可见pEGFP-C1/HBD2-E7c联合质粒的荧光蛋白表达。2. BALB/c小鼠经基因疫苗免疫后,pEGFP-C1/HBD2-E7c、pcDNA3.1(+)/-E7c、pcDNA3.1(+)/E7c和pEGFP-C1组与PBS对照组血清E7抗体间接ELISA法OD值差异有统计学意义(P<0.05),且pEGFP-C1/HBD2-E7c组抗体量较pcDNA3.1(+)/E7c升高。3.脾脏指数显示融合基因组即D组、B组、C组三组的脏器指数明显低于PBS对照组小鼠,融合基因组即pEGFP-C1/HBD2-E7c(?)(D组)脏器指数低于pcDNA3.1(+)/E7c质粒(B组),提示脾脏有一定萎缩。4.经流式分析仪分析发现,pEGFP-C1/HBD2-E7c组CD3+(Percp)/CD4+(FITC)阳性淋巴细胞数与其余三组差异有统计学意义(P<0.05),占脾淋巴细胞总数的42.52±4.42%,绝对计数为4190±144/10000个细胞,明显高于其余三组(P<0.05)：且pcDNA3.1(+)/E7c(B组)、pcDNA3.1(+)/E7c和pEGFP-C1组(C组)均显著高于PBS对照组(P<0.05),它们对应的绝对细胞计数分别为3830±138,3910±138和3100±133每10000个脾淋巴细胞。PBS对照组CD3+(Percp)/CD4+(FITC)阳性淋巴细胞数为3100±133/10000个细胞,与其余三组相比显著降低,且差异有统计学意义(P<0.05),其中pEGFP-C1/HBD2-E7c组占淋巴群体的百分率42.52±4.42%和绝对计数/10000个细胞明显高于pcDNA3.1(+)/E7c(B组)的39.4±3.78%和3830±138/10000以及pcDNA3.1(+)/E7c联合pEGFP-C1组(C组)的39.5±3.79%和3910±138/10000,但三者之间差异无统计学意义(P>0.05)。5. pEGFP-C1/HBD2-E7c组CD3+(Percp)/CD8+(PE)阳性细胞数与其他三组相比,差异有统计学意义(P<0.05),占脾淋巴细胞总数的50.16±4%,绝对计数为4970±140/10000个细胞,明显高于其余三组(P<0.05)；且pcDNA3.1(+)/E7c(B组)、pcDNA3.1(+)/E7c和pEGFP-C1组(C组)均显著高于PBS对照组(P<0.05),它们对应的绝对细胞计数分别为4120±127,3780±114和2300±133每10000个脾淋巴细胞。6. CD4/CD8比值的统计学分析结果表明,PBS组为1.35±0.46,显著高于其余三组(P<0.05),且pEGFP-C1/HBD2-E7c组最低,仅为0.84±0.03,但与pcDNA3.1(+)/E7c(B组)的0.95±0.04和pcDNA3.1(+)/E7c联合pEGFP-C1组(C组)的1.01±0.08相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论：1.pEGFP-C1/HBD2-E7c联合质粒构建成功,并在MCF7细胞中成功表达,在动物实验中发现pEGFP-C1/HBD2-E7c联合质粒有较强的免疫活性。2. BalB/C小鼠免疫试验表明,人β防御素2可明显改善HPV16E7基因的免疫原性,提高HPV16E7特异性抗体水平、增强以CD8+T细胞主的小鼠脾T淋巴细胞数量。