论文部分内容阅读
本文探讨了重组灵芝免疫调节蛋白(recombinant Ganoderma Lucidum immunoregulatory protein, rlz-8)诱导SGC7901胃癌细胞发生内质网应激进而介导自噬性细胞死亡的机制。在体外实验中,rlz-8可明显抑制SGC7901细胞增殖,使细胞阻滞于细胞周期的G0/G1期。将FITC与rlz-8偶联后利用激光共聚焦进行亚细胞定位检测结果显示：内质网可能是rlz-8发挥作用的靶位点之一。我们采用高通量基因芯片筛选技术对rlz-8诱导SGC7901细胞基因变化进行了检测,同时结合生物信息学分析了rlz-8诱导SGC7901细胞自噬性死亡过程中差异基因的变化,初步确定了rlz-8诱导内质网应激和自噬性细胞死亡的主要信号通路。利用免疫印迹和实时定量PCR技术检测了内质网应激相关标志分子GRP78、ATF4、CHOP的变化,实验结果显示,rlz-8触发SGC7901细胞自噬性死亡与内质网应激有关。利用电子显微镜观察结果表明,rlz-8能诱导细胞出现大量具有膜结构的自噬体和自噬溶酶体,ATF4、LC3B等细胞自噬相关分子的变化也证明rlz-8具有诱导细胞自噬的作用。利用RNA干扰技术抑制ATF4、CHOP的表达,可降低内质网应激强度和细胞自噬强度,rlz-8对SGC7901细胞的杀伤作用也随之降低。流式细胞仪对细胞凋亡率检测,没有发现caspases蛋白的调节活性,细胞线粒体膜电位无明显变化,caspases基因调节通路抑制剂不影响SGC7901细胞的死亡进程,这些结果显然证明,rlz-8杀伤SGC7901细胞的机制不是经典的细胞凋亡综上所述,rlz-8是通过诱导SGC7901细胞发生自噬性死亡而完成了对细胞的杀伤作用,且这种死亡方式由内质网应激所介导,其中ATF4——CHOP通路为关键信号传导通路。实验的创新之处在于：(1)研究课题揭示了一种外源蛋白定位在SGC-7901胃癌细胞的内质网中,由于过度积累引起内质网应激,进而触发自噬依赖性的肿瘤细胞死亡相关的分子机制,由于目前还未见与本研究相关的报道,研究成果将填补国际同类领域的空白。(2)基因芯片技术已经较为成熟,但是将这种高通量技术与下游的分析计算技术和算法结合来分析内质网应激与细胞自噬之间的关系及细胞自噬如何被调节走向死亡的分子机制的研究在国内外还未见报道。