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鸡球虫病是严重危害养禽业发展的重要疾病之一，目前对该病的防治还存在许多问题。pEtK2基因编码的钙调蛋白激酶(EtCDPK)存在于柔嫩艾美球虫子孢子(E. tenella)顶器中，能刺激感染球虫鸡的T淋巴细胞增殖。鸡白细胞介素2是机体免疫调节网络中具有重要免疫调节作用的生物活性物质，能刺激T细胞的生长和增殖，在机体免疫调节中起重要作用。本研究应用DNA重组技术将柔嫩艾美球虫pEtK2基因和鸡白细胞介素2(IL-2)基因分别克隆入原核和DNA疫苗载体，制备免疫调节型DNA疫苗，并用构建的DNA疫苗分别免疫动物，观察其诱导产生的特异性免疫应答，以及对E. tenella攻虫的保护作用。本研究主要分以下几个部分： 1．E. tenella pEtK2基因的克隆、鉴定及序列分析 根据国外报道的pEtK2基因序列，利用计算机设计一对引物，从纯化的E. tenella孢子化卵囊子孢子中提取总RNA，然后应用RT—PCR技术扩增出E. tenella pEtK2基因并对其进行测序。测序结果表明，pEtK2基因全长1464bp，具有一个完整的开放阅读框，编码487个氨基酸，与国外发表的序列比较，两序列问有10个碱基不同，其中3个无义突变，7个有义突变，同源性为99％。pEtK2基因编码55KD的钙结合域蛋白酶(EtCDPK)，推测可为子孢子的入侵提供重要的离子通道。 2．E. tenella pEtK2基因的原核表达及表达产物的纯化 应用DNA重组技术，将pEtK2基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)中，并转化大肠杆菌E. coli BL21，通过IPTG诱导表达重组pEtK2蛋白。SDS-PAGE电泳显示，表达的重组蛋白分子量在55KD左右，且在诱导表达5小时后表达量最多，约占总菌体蛋白的32％。细菌经超声波裂解破碎，TritonX-100洗涤，得到的包涵体被纯化，SDS-PAGE电泳显示，pET-28a(+)-pEtK2的表达产物绝大部分存在于包涵体中，上清中含量很少。MTT法检测了pET-28a(+)-pEtK2重组蛋白对球虫耐过鸡淋巴细胞的刺激效果。结果表明该重组蛋白能够刺激球虫耐过鸡T淋巴细胞增殖。 3．E. tenella免疫调节型DNA疫苗的构建 利用DNA重组技术，分别构建pVAX1-pEtK2，pcDNA4.0(c)-pEtK2，鸡柔嫩艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗pEtKZ一IL一2的研究pvAXI一pEtKZ一IL一2，pcDNA4.0(e)一pEtKZ一IL一2 DNA疫苗载体.酶切鉴定正确后，分别用重组质粒注射14日龄鸡，1周后取肌肉注射部位组织，RT一PCR，wes t ern-blotting检测保护性抗原的表达情况。结果表明该PEtKZ基因，IL一2基因均能在注射部位肌肉成功表达。4.丑t即时1a免疫调节型洲A疫苗的免疫保护性实验 pET一28a(+)一pEtKZ重组蛋白、重组质粒pVAXI一pEtKZ、pVAXI一pEtKZ一IL一2、peDNA4.0(e)一pEtKZ、peDNA4.0(e)一pEtKZ一IL一2经胸部肌肉分别予14、21日龄两次免疫小公雏.28日龄经口接种新鲜的丑t即口IZa袍子化卵囊.分别作盲肠病变记分(OPG)、卵囊排出数、增重、卵囊减少率、杭球虫指数(ACI)几个指标测定，确定其保护力的大小。结果表明，构建的丑t二己118免疫调节型DNA疫苗PEtKZ一儿一2能降低相对卵囊产量、减少盲肠病变、提高相对增重。PVAXI一PEtKZ一IL一2、PeDNA4.0(c)一EtKZ一IL一2试验组相对卵囊产童分别为29.89%和23.26%，盲肠病变记分分别为0.8和0.4，相对增重率分别为92.0%和97.80%，综合抗球虫指数(ACI)达到181.0和192.8.免疫保护效果良好，明显的优于其它试验组。有可能作为侯选的柔嫩艾美耳球虫的DNA疫苗.关健词:丑t即盯1a;pEtKZ;IL一2;DNA疫苗