车前科(Plantaginaceae)有3属,我国的车前属植物约18种。在我国,车前子定义为车前(Plantago asiatica L.,又称大粒车前)或平车前(Plantag depressa Willd.)的干燥成熟种子,是传统中医用药之一,有润肠通便、护肝、降低血清胆固醇等多项药理功效。其种皮所含的粘性多糖,具有通便、阻止有害物扩散、延长食物在胃内滞留时间等功能,因而可以调节体内血糖和血脂。本文以江西吉安产大粒车前子为研究对象,首先通过体内试验研究高粘性大粒车前子多糖润肠通便作用；然后通过现代色谱技术对大粒车前子多糖进行分离纯化,全面解析纯化后所得车前子多糖一级结构,为润肠通便组分提供结构信息；同时以钙为切入点,深入分析Ca2+对车前子多糖理化性质、结构和构象的作用,探索车前子多糖高粘性的内在机制。此外在研究过程中发现,多糖分离纯化较为繁琐、困难,在初步筛选车前子多糖、紫芝多糖、党参多糖、人参多糖和黄芪多糖在各种双水相体系中的分配系数后,最终挑选出分配系数相对较高的黄芪多糖作为研究对象,用高速逆流色谱(HSCCC)分离纯化,以期为多糖分离纯化提供新的思路。主要研究结论如下：1.研究了大粒车前子多糖对便秘模型小鼠的治疗效果。采用热水提取、乙醇沉淀法从大粒车前子中制备得到粗多糖PLCP,体内试验表明PLCP具有促进小鼠小肠蠕动、显著缩短燥结型和实热型便秘模型小鼠首次排黑时间,增加脾胃虚寒型便秘模型小鼠排便粒数。对于寒结型便秘小鼠,PLCP组能显著缩短首次排黑时间、增加排便粒数和排便重量。2.采用凝胶柱层析法对PLCP进行反复纯化得到PLP-1、PLP-2和PLP-3,并测定了三个组分的基本理化性质。PLP-1、PLP-2和PLP-3重均分子量分别为3.29×106、1.72×106和1.29×106Da。PLP-1、PLP-2和PLP-3的糖含量依次为79.18%、87.32%和82.08%,糖醛酸含量依次为17.48%、14.66%和20.13%,蛋白含量依次为0.03%、1.16%和0.04%。紫外可见光谱表明PLP-1、PLP-2和PLP-3在260、280nm处都基本无吸收,红外光谱分析证实PLP-1、PLP-2和PLP-3均为含有羧基和p-吡喃糖环结构的多糖。3.测定了PLP-1的一级结构。PLP-1由Rha (2.46%)、Ara (33.98%)、 Xyl (58.23%)、Man (0.83%)、Glc (2.23%)和Gal(2.36%)组成,糖醛酸以GlcA形式存在。PLP-1中主要糖残基有α-T-linked Araf(9.58%)、β-T-linked Xylp (8.71%).α-1,3-linked Araf(18.22%)、β-1,3-linkedXylp (8.05%)、β-1,4-linked Xylp (5.85%)、β-1,2,4-linked Xylp (16.98%)和β-1,3,4-linked Xylp (27.52%), GlcA以a-T-linked GlcAp形式存在,此外还有1,2-linked Rhap、T-linked Glcp.1,6-linked Glcp、T-linked Galp.1,3-linked Galp和1,3,6-linked Galp等少量其它残基。进一步通过部分酸水解、1D和2DNMR等方法,测定、解析得到了PLP-1可能的一级结构。4.测定了PLP-2的一级结构和固体形态。PLP-2由Rha (1.58%). Ara (31.65%)、Xyl (60.13%)、Man (1.58%)、Glc (1.90%)和Gal(3.16%)组成,糖醛酸以GlcA形式存在。PLP-2中主要糖残基有α-T-linked Araf(7.37%)、 β-T-linked Xylp(13.45%)、a-1,3-linked Araf(11.23%)、β-1,3-linked Xylp(4.09%). β-1,4-linked Xylp (4.33%)、β-1,2,4-linked Xylp (12.28%)和β-1,3,4-linked Xylp (29.12%), GlcA以α-T-linked GlcAp形式存在,此外还有1,4-linked Glcp、1,6-linked Glcp、1,3,4-linked Galp、1,3,6-linked Glcp、 T-linked Rhap.1,3-linked Rhap和1,4-linked Galp等少量其它残基。进一步通过部分酸水解、草酸解、1D和2DNMR等方法,测定、解析得到了PLP-2可能的一级结构。SEM图谱显示PLP-2为线性聚集体。5.测定了PLP-3的一级结构。PLP-3由Rha (1.85%). Ara (39.65%). Xyl (55.93%). Glc (0.83%)和Gal(1.83%)组成,糖醛酸以GlcA形式存在。PLP-3主要糖残基有α-T-linked Araf(8.13%)、β-T-linked Xylp (15.58%)、α-1,3-linked Araf(16.82%)、β-1,3-linked Xylp (7.47%)、β-1,4-linked Xylp (5.24%). β-1,2,4-linked Xylp (17.87%)和β-1,3,4-linked Xylp(24.24%), GlcA以α-T-linked GlcAp形式存在。此外还有T-linked Glcp、1,2-linked Glcp和T-linked Galp等少量其它残基。进一步通过部分酸水解、1D和2D NMR等方法,测定、解析得到了PLP-3可能的一级结构。6.研究了大粒车前子多糖PLCP的流变性能。车前子多糖PLCP表观粘度较大且随着多糖浓度增加而增加,表现出假塑性流体性质。1.0%PLCP溶液便开始表现出弱凝胶性质,增加温度能显著降低多糖的表观粘度。NaCl和CaCl2能显著增加PLCP的表观粘度,特别是CaCl2对多糖表观粘度有极大促进作用。CaCl2在低浓度下便能提高PLCP的成胶性能,提高胶的热稳定性,而NaCl需要在较高浓度下才能促进PLCP的成胶性。7.研究了Ca2+对大粒车前子多糖理化性质的影响。车前子多糖中富含Ca,其含量随着多糖纯度的提高而显著上升。通过单因素实验优化EDTA螫合车前子多糖中Ca的条件,得到了脱除了Ca的多糖PLCP-E。和PLCP相比,PLCP-E结构基本未发生改变,但表观粘度下降显著。加入Ca2+能显著提高PLCP-E表观粘度,Ca2+与PLCP-E相互作用一段时间后再透析除去游离的Ca2+,所得到的多糖其表观粘度和成胶性能与同等浓度的PLCP相当。PLCP中检测出阿魏酸(0.61mg/g),脱除阿魏酸后的多糖PLCP-FAR表观粘度急剧下降,但是加入Ca2+不能与PLCP-FAR再重新螫合,多糖表观粘度未能恢复。并进一步通过SEM观察、热稳定性分析等,再结合车前子多糖结构分析结果和前人研究,推断出Ca和车前子多糖可能的相互作用关系。车前子多糖中的Ca应以二价离子形式存在(Ca2+), Ca2+主要与连接在多糖链上的GlcA、阿魏酸相互作用(主要是与阿魏酸相互作用),从而使得多糖链之间相互交联在一起,这种相互作用有助于车前子多糖具有较高的粘度、成胶性能、良好的热稳定性以及线性链状形态。8.以PLCP和PLCP-E为研究对象,考察Ca2+对车前子多糖溶液构象的影响。在相同溶剂中(纯水、0.1MNaCl和0.5MNaOH), PLCP-E的特性粘度均低于PLCP特性粘度,同时PLCP-E表观直径也更低。静态激光光散射实验结果表明,0.5MNaOH为PLCP和PLCP-E的良好溶剂,PLCP和PLCP-E的Mw分别为1.60×106和1.17×106Da,构象参数ρ显示PLCP-E的刚性结构增强。HPSEC结果表明,PLCP-E的多分散指数(Mw/Mn)变大,而Mw比PLCP小,这说明EDTA处理使得多糖分子量降低,分子量分布变宽。PLCP-E的Mark-Houwink指数a值为0.55,高于PLCP-E的0.51。通过蠕虫链模型计算得到PLCP的持续围长Lp值为1.1nm,而PLCP-E的Lp值为7.8nm。上述实验结果表明,PLCP-E刚性结构增强。9.利用HSCCC结合双水相技术,系统研究多糖分离纯化新方法。首先利用单因素结合正交实验优化黄芪多糖在PEG-MgSO4-Water体系中的分配系数,当MgSO4浓度为16.0%、PEG浓度为12.0%、PEG分子量为1000,黄芪多糖在此双水相体系中有最大分配系数(0.56±0.04)。利用优化的PEG-MgSO4-Water双水相体系,对黄芪水提物(2.2g)直接进行HSCCC分离,得到RAWE-H-A(43mg,得率1.95%)和RAWE-H-B (50mg,得率为2.27%)两个组分。GPC图谱显示,RAWE-H-A的纯度较高,重均分子量为1.09×106Da,而RAWE-H-B的纯度则较低,重均分子量为1.33-2.32×105Da。测定了RAWE-H-A基本结构特征,结果显示其和利用传统方法纯化得到的黄芪主要多糖RAP结构较为接近,但两者还是存在一定区别。