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白念珠菌是人体常见的条件致病真菌，2010年，美国的一项调查研究表明[1]：念珠菌属已经占了医院获得性系统性感染的第四位，其死亡率上升至50%，其中白念珠菌毒力最强、临床最常见，目前已成为国内外学者的研究热点。众多学者认为[2][3]：人类的胃肠道是白念珠菌的主要储存库，同时也是系统性白念珠菌感染主要来源。当人体抵抗力下降时，如：HIV感染、长期使用广谱抗生素、肿瘤放化疗后，白念珠菌就表现为很强的侵袭力，能穿透肠粘膜屏障、引起系统性白念珠菌感染，常常危及生命[4]。因此，以白念珠菌与肠粘膜上皮相互作用为出发点，研究其致病机制，对预防和治疗肠道来源的系统性白念珠菌感染具有重要意义。早在1996年，上海生物化学研究所陈江野教授及其团队利用寡核苷酸探针技术筛选得到了CRK1基因，它是一种细胞周期蛋白2（CDC2）相关性蛋白激酶。研究发现[5]：Crk1蛋白与酿酒酵母的Sgv1蛋白及人类Pk11/Cdk9蛋白相似，在多种培养条件下，如：YPD培养基、Lee’s培养基等，CRK1基因缺失影响到白念珠菌的生长速度和形态发生。因此，我们拟在前人研究的基础上，通过比较CRK1基因缺失前后（即：标准菌SC5314及ΔCRK1菌），菌株在生物被膜的形成、黏附、侵袭以及由此引发的宿主免疫反应等方面的差异，了解CRK1基因缺失对白念珠菌与肠粘膜上皮相互作用的影响，进一步阐明肠道来源的念珠菌病的发病机制。生物被膜的形成常常被认为是白念珠菌重要的毒力因素之一。为比较ΔCRK1菌及标准菌SC5314形成生物被膜的差异，我们通过扫描电镜，从形态学上观察两者之间的差异，ΔCRK1菌：可见大量伸长的菌丝、相互交织、排列紧密并铺满瓶底，但与标准菌SC5314相比，形成的生物被膜较疏松，中央仍依稀可见散在的空隙；而标准菌SC5314：可见大量伸长的菌丝和酵母细胞在细胞外基质中相互交织，排列紧密、呈现多层膜状结构。同时，我们应用MTT法（波长为490nm）及结晶紫法（波长为620nm），通过比较各个波长处吸收峰的大小，评价生物被膜中细胞数目及细胞外高分子物质的多少，从而比较ΔCRK1菌及标准准SC5314形成生物被膜的差异，吸光度越大，说明形成的生物被膜越好，结果两种方法均表明：ΔCRK1菌形成的生物被膜的吸光度小于标准菌SC5314，两者之间有统计学差异。实验结果说明：CRK1基因缺失不利于白念珠菌生物被膜的形成。Caco-2细胞是一种来源于人结直肠腺癌细胞株，在普通培养条件下，能分化成小肠上皮细胞单层，具有微绒毛等结构。为研究CRK1基因缺失对白念珠菌黏附于肠粘膜上皮的影响，本实验利用Caco-2细胞体外构建肠粘膜上皮，应用PAS染色（糖原染色）于显微镜下观察白念珠菌与肠粘膜相互作用的不同时间点（30、60、90、120min），ΔCRK1菌及标准菌SC5314黏附于肠粘膜上皮的形态特点；同时，应用菌落计数法比较两者之间的差异，结果表明：随着时间的延长，ΔCRK1菌及标准菌SC5314黏附于肠粘膜的菌落数逐渐增多，均在90min时达到最多，之后逐渐减少，且在60、90min时，SC5314菌的黏附数均多于ΔCRK1菌，两者之间有统计学意义。为进一步研究CRK1基因缺失对白念珠菌穿透肠粘膜的影响，我们通过菌落计数法，比较标准菌SC5314及ΔCRK1菌与肠粘膜相互作用6h、24h时穿透肠粘膜的菌落数，结果表明：当白念珠菌与肠粘膜相互作用6h时，ΔCRK1菌及标准菌SC5314穿透肠粘膜的菌落数均很少，两者之间无统计学差异，而在24h时，ΔCRK1菌穿透肠粘膜的菌落数明显少于标准菌SC5314，两者比较有统计学差异。结果说明：CRK1基因缺失导致白念珠菌穿透肠粘膜的能力下降。当白念珠菌作用于肠粘膜上皮时，会诱发宿主细胞产生一系列的炎症反应，导致一系列细胞因子的释放，因此，为研究CRK1基因缺失导致肠粘膜上皮细胞因子的表达差异，我们采用ELISA方法从蛋白水平对常见的促炎细胞因子（IFN-γ，IL-8，TNF-α）和抗炎细胞因子（IL-10，IL-12，TGF-β）进行分析比较，实验结果表明：与标准菌SC5314相比，ΔCRK1菌作用于宿主细胞后，诱发产生的促炎细胞因子TNF-α、IL-8、IFN-γ的水平相对较高，而对于抗炎细胞因子IL-12，TGF-β、IL-10，则标准菌SC5314多于ΔCRK1菌，两者比较均有统计学差异。促炎细胞因子在病原菌入侵时发挥抗菌作用，使病原菌更易于被宿主抵抗，我们可以推断：相对于标准菌SC5314，ΔCRK1菌易于被宿主抵抗，因而其对宿主的致病力降低。总之，我们从生物被膜的形成、黏附并侵袭肠粘膜上皮以及宿主细胞因子的释放等几个方面,对CRK1基因缺失影响白念珠菌与肠粘膜上皮相互作用进行了研究。我们发现：CRK1基因缺失影响白念珠菌生物被膜的形成，同时使白念珠菌黏附、穿透肠粘膜上皮的能力下降，当ΔCRK1菌作用于宿主细胞后，诱发产生的促炎细胞因子TNF-α、IL-8、IFN-γ的水平相对较高，而对于抗炎细胞因子IL-12，TGF-β、IL-10，相对较少，与标准菌SC5314相比，两者之间有统计学差。结果说明了：由于CDC2家族的蛋白激酶在真核生物周期的调控中起着关键作用，CRK1基因作为CDC2相关的蛋白激酶，可能也参与细胞周期的调控。本研究证实了CRK1基因从多个方面影响了白念珠菌与肠粘膜细胞的相互作用。