研究背景种植体能在临床上长期存留并行使功能与其骨整合有密切的关系,这已是口腔种植的基本理论基础,而早期骨整合在种植体成功率上又起着举足轻重的作用。据报道,目前临床所用种植体与周围骨组织整合面积只有50%-75%,而大部分种植体的失败则是由于早期没有完全建立骨整合而导致骨-种植体界面破坏。理解生物材料与细胞之间复杂的相互作用可以促进生物医学的发展。据研究,影响种植体骨整合的因素有很多,大部分学者从种植体本身的角度来进行深入的研究。其中,种植体表面特性在种植体-骨界面愈合过程中起着非常重要的作用。大量研究证实,种植体经相应表面处理后可以促进蛋白和细胞在表面的粘附,从而促进接触成骨,实现种植体周围双向成骨的骨愈合模式。众多研究及本课题组前期实验均证实,种植体表面清洁度在很大程度上影响其生物活性及早期骨整合。研究表明,纯钛在周围环境中自发氧化形成惰性二氧化钛(Ti02)氧化膜层使表面具有良好的生物活性、生物相容性和抗腐蚀性。然而,这层氧化膜在1分钟甚至几秒钟就会吸附空气中无机离子和有机污染物,使得表面化学组成改变,并降低了表面自由能。另外,纯钛表面存在“老化”的现象,即表面生物活性随着时间的延长而出现降低,骨引导作用下降,抑制了成骨细胞向表面的趋化,以及后期的增殖和分化功能。然而临床上大多数种植体的产品信息和使用说明上均没有相关生产日期或储存时间,只标明了过期时间,一般是5年。这样就使种植体不可避免的与空气接触,造成表面的污染,并出现老化现象。研究证实氧化膜表面吸附的污染物主要为含碳基的无机离子和有机吸附物,而表面碳原子的含量与蛋白和细胞的粘附存在负相关关系,因此这些污染物降低了表面的生物活性,不利于骨结合的早期形成,导致这种被污染的氧化层不适合种植体与周围环境的相互作用。如何有效地去除纯钛表面的这层污染,提高纯钛表面的高生物活性,从而促进新骨在种植体周围快速生长成为本课题主要的研究方向。目前清洗纯钛的方法主要有机械物理清洗和化学清洗,但这些方法会造成表面形貌和表面化学基团的破坏。近几年用紫外辐照纯钛表面可以恢复甚至提高纯钛生物活性的研究甚多,这种方法主要是利用二氧化钛光催化作用在不破坏纯钛表面形貌的前提下改变表面化学结构组成,并有效地去除表面吸附的碳氢化合物等有机吸附污染物。1997年Wang发现紫外光处理Ti02氧化膜可以产生超亲水性表面并在Nature上发表。本课题组前期实验也证实了紫外辐照可以去除纯钛表面吸附的碳氢化合物等有机污染物,促进细胞早期在纯钛表面的反应。另外,国际著名的美国骨种植科学实验室(Laboratory for Bone and Implant Science, LBIS)以Ogawa学者为首的众学者等用紫外线处理酸蚀纯钛表面后产生超亲水性表面,促进了纯钛表面细胞活性,动物实验中种植体骨接触(Bone-implant contact, BIC)由75%上升至98.2%。然而,LBIS用紫外线处理酸蚀纯钛表面并没有Ti02晶型的存在,从而推断光催化作用来自于空气中自发氧化形成的Ti02膜。研究表明,Ti02氧化膜厚度可以影响光催化活性。另有研究证实,酸蚀纯钛表面进行进一步的Ti02颗粒喷涂可以增强光催化作用。从这些大量的研究中我们可以推断出,仅仅依靠纯钛表面自发氧化形成的二氧化钛膜层产生的光催化作用还是不够的,尚有很大的提升空间。因此我们考虑如何进一步在保证纯钛表面形貌不变的前提下增强光催化作用,从而更有效地去除纯钛表面在空气中吸附的污染物。其实,Ti02作为光催化剂广泛应用于水污染的治理和环境污染领域。纳米二氧化钛因其具有小尺寸效应、表面效应等纳米颗粒的特点,使其在空气净化、废水处理以及自清洁方面得到广泛应用。二氧化钛纳米线是一种具有横向为纳米级尺寸,而在纵向没有限制的一维结构。一维结构的纳米线因为具有较高的电荷载流子传输效率和离子分散能力,使其具有较强的电荷收集效率,可使光生载流子在纳米线上沿着一维的长轴方向的传递,从而减少了光电子的损失。另外,二氧化钛纳米线相对纳米颗粒和二氧化钛薄膜而言具有更小的微粒尺寸和更大的比表面积,从而表现出更好的光催化性能,而且具有良好的化学稳定性、无毒、低成本等优点,因此近年来二氧化钛纳米线的研究得到广泛的关注。Ti02通常有三种晶型：锐钛矿、金红石和板钛矿。锐钛矿在3.2 ev这样一个较低的光子能量下就可以生成光生电子和光生空穴,从而发生光催化作用,成为光催化活性最高的一种晶型,所以在水污染治理和环境污染领域多选择纳米锐钛矿颗粒。但是,其光生电子和光生空穴复合的速率仍然很快,导致量子效率降低。其实目前二氧化钛光催化剂的量子效率只有4%左右,这就大大限制了锐钛矿的光催化活性。TiO2-B是相对稳定的单斜晶系二氧化钛,其能量带隙接近锐钛矿,但是其导带高于锐钛矿,因此,TiO2-B和锐钛矿可以组成一种Ⅱ级半导体异质结构,可以促进它们之间电荷的转移,从而增强光催化作用。 Liu等学者已经对TiO2-B和锐钛矿组合在一起的核壳纳米线进行了初步的研究,证明了此种纳米线具有比单一晶型存在时具有更强的光催化作用。因此这种TiO2-B和锐钛矿组合的核壳纳米线作为光催化剂,无论是在表面形貌、比表面积,光催化剂的量以及晶型结构方面均具有明显的优势。因此,本研究即希望通过制备出TiO2-B和锐钛矿组合的核壳纳米线,即TiO2-B@锐钛矿核壳纳米线(TiO2-B@ANWs),利用TiO2-B@ANWs纳米线的光催化作用对纯钛表面进行清洗,期望可以有效的去除纯钛表面在空气中吸附的污染物,消除这些影响早期骨整合的因素,促进纯钛表面早期的细胞反应,促进早期骨整合的建立,达到缩短临床治疗时间,从而提高种植牙的成功率。研究目的(1)探索TiO2-B@ANWs核壳纳米线光催化作用处理对纯钛表面污染物清除的效果。(2)探索经Ti02.B@ANWs核壳纳米线光催化作用处理纯钛表面后的生物学活性。研究方法1.TiO2-B@ANWs核壳纳米线的制备和表征(1)TiO2-B@ANWs核壳纳米线的制备通过碱热方法在备用的钛片表面制备出稳定的、重复性好的TiO2-B@ANWs核壳纳米线。(2)TiO2-B@ANWs核壳纳米线的表征采用扫描电镜和透射电镜观察制备的纳米线表面形貌；用X射线能谱仪分析表面元素含量；X射线衍射仪检测表面晶型结构；用OCA表面接触角分析仪检测表面静态接触角大小；采用表面形貌仪测量表面粗糙度。2.采用亚甲基蓝降解实验和羟基自由基(·OH)间接检测实验分析TiO2-B@ ANWs核壳纳米线的光催化降解能力和光催化活性：3.TiO2-B@ANWs核壳纳米线光催化作用清洗纯钛表面的体外细胞学活性研究(1)TiO2-B@ANWs核壳纳米线光催化作用清洗纯钛后表面理化性质检测采用扫描电镜观察钛片表面形貌；采用X射线衍射仪检测各组钛片表面晶相组成；采用表面形貌仪测量表面粗糙度；用OCA表面接触角分析仪检测表面静态接触角大小,反应各组钛片表面亲水性；采用X-射线光电子能谱仪对各组钛片表面进行表面元素化学状态分析。(2)蛋白吸附试验及细胞学实验采用BCA蛋白试剂盒检测各组钛片表面蛋白吸附情况；利用扫面电镜和荧光显微镜下观察各组钛片表面细胞形态,并在荧光显微镜下摄片用于计数计算细胞粘附情况,比较各组钛片表面细胞粘附率；通过Transwell实验检测细胞向各组钛片表面的趋化迁移能力；用MTS检测试剂盒检测各组细胞增殖活性；采用荧光实时定量聚合酶链式反应(Real-time Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)技术检测各组钛片表面细胞ALP(Alkaline Phosphatase)和OCN(Osteocalcin)成骨基因的表达情况,并通过茜素红和von Kossa染色法比较各组钛片表面细胞后期矿化能力。4.TiO2-B@ANWs核壳纳米线光催化作用清洗纯钛种植体表面的动物实验研究以Beagle犬为动物模型,并将4只Beagle随机分配为2 w组和4 w组。按照随机分配的原则将三组不同种植体(SLA组,UV-SLA组,NWs+UV-SLA组)循环植入胫骨上段,植入位点及方法如下：以每侧胫骨骨骺线远心端2 cm处为第一颗植体植入位点,依次向远心方向在胫骨长轴中心线上并垂直于胫骨外侧面以间距1 cm共植入6颗钛种植体。于既定时间在Beagle犬颈部皮下注射四环素和钙黄绿素进行荧光标记,并在2 w和4 w两个时间点处死相应动物。制备硬组织切片后在荧光显微镜下观察各组种植体周围新骨形成情况,并利用甲苯胺蓝染色后在光学显微镜下摄片对骨-种植体接触(Bone-implant contact,BIC)和新生骨面积百分数(Bone area,BA)相关参数进行计算比较。5.采用SPSS13.0统计学分析软件,测定结果均以x±s来表示。如实验存在组别和时间两个因素时首先采用析因设计分析处理因素间是否存在交互效应,各组间进一步按照单因素方差进行分析,用Levene’s test检验方差齐性,如方差齐则进一步采用LSD检验对各组间样本均数进行两两比较；如方差不齐则采用近似F检验的Welch方法来进行方差分析,采用Dunnett’s T3检验进行组间样本均数两两比较。如实验只有组别一个因素时,按上述直接采用单因素方差分析。假设检验为双侧检验,检验水准a=0.05,P<0.05时各组间差异具有统计学意义。结果1.TiO2-B@ANWs核壳纳米线的制备和表面特性检测(1)本研究采用碱热方法在钛片表面制备出TiO2-B@ANWs纳米线,主要包括四个过程。首先,钛片经碱热处理使其表面生成STi@NWs纳米线。第二,STi@NWs纳米线与稀盐酸发生置换反应,使其中的Na+置换出来,从而制备出HTi@NWs纳米线。第三,HTi@NWs纳米线在TICl4溶液中使得表面生成锐钛矿Ti02颗粒,即HTi@ANWs纳米线的生成。最后,经加热使得HTi@ANWs纳米线晶型发生改变,最终生成TiO2.B@ANWs纳米线。结合表面晶型结构检测,可知TiO2.B@ANWs核壳纳米线是以TiO2-B为中心的核和以锐钛矿为表面的壳组成的复合晶型结构,其制备过程中经历了四种不同性质的纳米线：STi@NWs、HTi@NWs、HTi@ANWs、TiO2、B@ANWs。(2)TiO2-B@ANWs制备过程中因置于TiCl4溶液中加热时间不同呈现出透射电镜下不同的表面形貌。随着时间的延长,TiO2-B棒状纳米线周围绒毛状物质锐钛矿沉积越来越多,4 h时基本将其全部覆盖,形成明显的由TiO2-B组成的核和由锐钛矿组成的壳的外形,而浸泡6 h后TiO2-B表面的锐钛矿密度更大,甚至出现复层沉积。(3)生成的STi@NWs,HTi@NWs,HTi@ANWs和TiO2-B@ANWs四种纳米线的纯钛表面肉眼观均为淡蓝色,色泽均匀一致,轻度磨砂感。扫描电镜和透射电镜下观察,可知STi@NWs和HTi@NWs两种纳米线形貌无明显的差别,均为单一的棒状纳米线,直径为90nm-110mn。HTi@ANWs和TiO2-B@ANWs两种纳米线也具有相似的表面形貌,即在原有的STi@NWs和HTi@NWs棒状纳米线周围又有绒毛状物质锐钛矿沉积生成,直径约为130 nm。(4)亲水性实验中,除抛光组钛片表面接触角为(81.69±13.32)°,为疏水性表面外,STi@NWs,HTi@NWs,HTi@ANWs和TiO2-B@ANWs组表面接触角均为0°,为超亲水性表面。(5)X射线能谱仪检测到五组钛片表面主要包括Ti,O和C三种元素,另外还可以检测到少量的N,Na,Si和C1元素,但各组的元素含量比例存在一定的差异性。(6)四种纳米线STi@NWs,HTi@NWs,HTi@ANWs和TiO2-B@ANWs组表面粗糙度参数(Ra和Rq)均大于抛光钛片PT组,Ra值(F=251.791,P=0.000),Rq值(F=239.403,P=0.000)。四种纳米线组间差异无统计学意义(P>0.05)。2.亚甲基蓝降解实验和羟基自由基间接检测实验分析TiO2-B@ANWs核壳纳米线的光催化降解能力和光催化活性(1)在制备TiO2-B@ANWs核壳纳米线过程中产生的四种纳米线STi@NWs, HTi@NWs,HTi@ANWs和TiO2-B@ANWs中TiO2-B@ANWs光催化能力最强。(2)在TiCl4溶液中分别恒温加热1 h,2h,4 h,6 h后制备出的TiO2-B@ANWs核壳纳米线光催化降解能力在4 h内是随着时间的延长光催化降解亚甲基蓝的效率是逐渐增强的,但是加热6 h后制备的TiO2-B@ANWs其光催化效率反而下降,而低于加热4 h后生成的纳米线(P<0.05),差异具有统计学意义。(3)在20 mg,50 mg,100 mg和150 mg四组不同浓度的TiO2-B@ANWs核壳纳米线溶于相同体积500 ml亚甲基蓝溶液中光催化降解效率比较中证实,100mg的TiO2-B@ANWs核壳纳米线光催化降解能力最强。(4)根据光催化反应处理因素及阴性对照组此部分实验可分为四组：紫外光组(UV),TiO2-B@ANWs核壳纳米线组(NWs),紫外光+TiO2.B@ANWs核壳纳米线组(NWs+UV)及阴性对照组纳米锐钛矿组(TiO2+UV).在光催化降解亚甲基蓝实验和羟基自由基间接检测实验中得出TiO2-B@ANWs核壳纳米线光催化处理组,即NWs+UV组光催化作用最强。3.TiO2-B@ANWs核壳纳米线光催化作用清洗纯钛表面的体外细胞学活性研究(1)经TiO2-B@ANWs核壳纳米线光催化作用清洗纯钛后表面理化性质检测三组纯钛表面形貌相似,均分布由喷砂和酸蚀形成的弹坑样微米级一级孔洞和蜂窝状微纳米级二级孔洞。三组间表面晶型和表面粗糙度也没有差异。亲水性检测发现对照组SLA表面为疏水性表面,Uv-SLA和NWs+UV-SLA两组表面接触角均为0°,为超亲水性表面。经XPS进行表面元素化合状态检测分析,三组钛片表面主要含有Ti、C和O三种元素。C元素中C 1s主要结合能峰284.8eV处对应C-H和C-C中的C和结合能峰286.4 eV处对应C-O中的C,实验组UV-SLA和NWs+UV-SLA两组钛片表面此两处结合能峰值均下降,以结合能峰284.8 eV处下降明显。0元素中Ols主要结合能峰530.1 eV代表氧化物中的O2-,分析为Ti02中的O元素,实验组UV-SLA和NWs+UV.SLA两组钛片表面此两处结合能峰值均升高。结合能峰531.3 eV处对应Ti-OH的O元素,主要来纯钛表面的-OH,UV-SLA和NWs+UV-SLA两组处理的喷砂酸蚀纯钛表面此处结合能峰值略微增高。Ti元素中Ti 2p分为结合能峰458.5 eV处的Ti 2p3/2和结合能峰464.2 eV处的Ti2p1/2,均代表Ti02中的Ti元素。相对于SLA组,UV-SLA和NWs+UV-SLA两组处理的喷砂酸蚀纯钛表面在Ti 2p的两处结合能峰值均有一定的升高。(2)蛋白吸附实验及细胞学实验三组钛片表面2h、6h和24 h后蛋白吸附均以前2h蛋白吸附速率最快,以NWs+UV-SLA组吸附率最大,达到40%左右。三组钛片表面细胞随着培养时间1h,2h和4h的延长,钛片表面的细胞由开始的球状外形逐渐伸展开来,以NWs+UV-SLA组钛片表面细胞生长速度最快,在培养4h后,表面细胞有粗壮的伪足伸出,细胞长度接近40 gm。各组表面细胞粘附数量随着孵育时间延长而增加,在不同时间点均以NWs+UV-SLA组表面细胞粘附率最高,组间差异具有统计学意义(P＜0.05)。Transwell实验证实NWs+UV-SLA组细胞在24 h内向钛片表面迁移数目最多(F=17.017,P=0.000)。各组细胞增殖活性在5 d内均随着时间的延长有显著的增加,在每个时间点均以NWs+UV-SLA组增加最快(P<0.05)。三组钛片表面矿化基因ALP在7 d时均高于21 d,以NWs+UV-SLA组在7 d时表达最高(F=17.020, P=0.003)。三组钛片表面OCN矿化基因在21 d均高于7 d的表达,以NWs+UV-SLA组在21 d时表达最高(F=32.417,P=0.001)。茜素红和von Kossa染色实验中也证实,NWs+UV-SLA组21 d时表面染色最深,UV-SLA次之,SLA组染色最浅。4. TiO2-B@ANWs核壳纳米线光催化作用清洗纯钛种植体表面的动物实验研究荧光显微镜下SLA、UV-SLA和NWs+UV-SLA各组在2 w和4 w时种植体螺纹间梯形凹槽骨缺损区内均有不等量荧光着色新生骨小梁生成,且4 w时较2 w时密度明显增多,特别是NWs+UV-SLA组在4 w时梯形凹槽骨缺损区几乎充满新生骨,其次为UV-SLA组,凹槽内新生骨质也接近充满,对照组SLA新生骨质最少。甲苯胺蓝染色后光学显微镜下观察,SLA、UV-SLA和NWs+UV-SLA各组在2 w和4 w时种植体螺纹间梯形凹槽骨缺损区内均可见蓝染的新生骨小梁条带向其中长入,大部分骨小梁条带沿着种植体梯形凹槽的侧壁向骨缺损区内生长。与荧光显微镜下结果一致,三组种植体在4 w时较2 w时螺纹间梯形凹槽骨缺损区内种植体-骨接触和新骨生成面积都有显著的增大(P<0.05),骨小梁也相对变得粗大并相互融合。对BIC数值进行统计学分析,NWs+UV-SLA组在2w和4w时分别达到48%和68%左右,均大于UV-SLA组和SLA组(P<0.05)。UV-SLA组在两个时间点的BIC较SLA组大,差异具有统计学意义(P<0.05)。对BA数值进行统计学分析,NWs+UV-SLA组在2w和4w时分别达到29%和47%左右,均大于UV-SLA组和SLA组(P<0.05)。UV-SLA组在两个时间点的新骨生成量较SLA组多(P<0.05)。结论1.采用碱热方法在钛片表面可以制备出光催化活性较强的TiO2-B@ANWs核壳纳米线。2.体外实验证明,经TiO2-B@ANWs核壳纳米线光催化作用清洗纯钛表面细胞生物活性提高。3.动物实验证明,经TiO2-B@ANWs核壳纳米线光催化作用清洗的钛种植体促进早期新骨在种植体周围的生成,有利于早期骨整合的建立。