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南极假丝酵母脂肪酶B （Candida antarctica lipase B, CALB）具有广谱底物接受性和对映体选择性,广泛应用于食品、化工、前体药物的合成和生物能源等领域。利用基因工程技术实现其异源高效表达,对该酶的工业化生产具有重要意义。本研究以C. antarctica LF058菌株lipB基因（GenBank: Z30645.1）为出发基因,为提高CalB在毕赤酵母（Pichia pastoris）中的表达量,在利用生物信息学技术对CalB进行了密码子优化和改造的基础上,采用PCR-based accurate synthesis全基因合成方法（PAS）分别合成了原始基因CalB与优化后基因CalBM;以CalB和CalBM基因为基础,构建了一系列适于在P. pastoris中表达的组成型和诱导型载体,并分别转至P. pastoris GS115、SMD1168和X-33中,实现了该基因在各宿主菌中的功能性表达,获得了高效表达的基因工程菌,并初步分析了重组CALB的酶学性质。本文主要工作如下:1.为提高CalB在P. pastoris中的表达量,在DNA2.0软件的辅助下,以P. pastoris密码子使用频率为基准,在不改变氨基酸顺序的前提下,将Leu、Thr、Gly、Val、Ala、Arg、Ser、Pro、Lys、Ile、Gln、Tyr、Asn、Phe、Cys和Asp等在P. pastoris中使用频率低的密码子进行了改造。共计172个位点的低频密码子替换为使用频率最高、次高频和第三高频密码子;优化了CalB基因的G+C含量,优化基因G+C含量为53.99%（优化前为61.89%）;在碱基编排过程中去除了富含GC和AT的区域,降低了RNA二级结构的复杂性。2.基于PAS全基因合成技术合成了CalBSP,CalBP,CalB和CalB His-tag四种不同一级结构形式的基因。3.本研究以原始基因（CalB）和优化基因（CalBM）为外源基因,以pPIC9K、pPIC9KM和pPICZα为诱导型表达载体,以pGAPZα为组成型表达载体,构建了pPIC9K-CalB、pPIC9KM-CalB、pGAPZα-CalB、pPICZα-CalB、pPIC9K-CalBM、pPIC9KM-CalBM、pGAPZα-CalBM、pPICZα-CalBM、pPIC9K-CalB-His和pPIC9K-CalBM-His 10个重组表达质粒,并分别转至P. pastoris GS115、SMD1168和X-33,实现了各基因在宿主菌中的功能性表达,获得了高效表达的基因工程菌。结果表明,密码子优化明显提高了CalB在P. pastoris中的水解酶活与蛋白表达量,较原始基因提高40%了左右。以pPICZα为表达载体,X-33为宿主菌株筛选到的转化子表达水平最高,最高辛酸乙酯水解活力和最高总蛋白表达量分别为246.3 U/mL和179.1 mg/L。4.对经Ni-NTA亲和层析和超滤浓缩纯化的CALB进行SDS-PAGE分析,发现在CalB基因在P. pastoris中表达产物的大小为35 kDa（含糖基化侧链）。经Endo H糖苷内切酶酶切的CALB约为33 kDa,与实际CALB大小一致,证实了CALB在P. pastoris的异源表达蛋白加工过程中进行了糖基化修饰。5.对重组CALB进行了初步的酶学性质分析。结果表明,CALB的最适底物为C8,最适反应温度和pH分别为40℃和pH 8.0;Ca2+、Mg2+、K+和吐温80对其水解有激活作用;Cu2+、TrionX-100与SDS对其水解具有抑制作用。