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目的:筛选鉴定结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)干细胞特性相关基因,并探讨筛选出的干性相关基因lncRNA-cCSC1对结直肠癌干细胞特性的生物学行为影响及其作用机制。方法:1)在TCGA(https://cancergenome.nih.gov/)下载结直肠癌stem-like和non stem-like组织亚型的RNA-Seq预处理数据并通过TCGA标识码相互匹配。采用Limma算法对数据进行差异表达分析,挑选出其中差异表达的lncRNA并进行聚类分析。选取其中表达量最高的10个lncRNA与22个经典干性标志物进行相关性矩阵分析筛选出相关性最高的关键lncRNA并根据lncRNA相关命名规则将其命名为lncRNA-cCSC1。通过相关数据库明确lncRNA-cCSC1的染色体位置,并验证其序列全长及细胞定位。相关软件预测分析其蛋白编码能力,判定是否具备lncRNA的特征。2)QRT-PCR检测lncRNA-cCSC1在结直肠癌组织及癌旁正常组织中的表达情况,并结合临床病理资料分析lncRNA-cCSC1的表达与临床病理特征和总体预后的关系。用QRT-PCR继续检测lncRNA-cCSC1在六种常见的结直肠癌细胞系及人正常肠上皮细胞中的表达情况,从中挑选出表达量最明显的HCT116和HT29两株细胞用于后续实验。随后用免疫磁珠法从这两株细胞系中分选出CD133~+CD44~+和CD133~-CD44~-细胞,并用流式细胞仪检测分选纯度。QRT-PCR检测CD133~+CD44~+和球细胞中lncRNA-cCSC1的表达量,CD133~-CD44~-和贴壁细胞分别作为其对照组。3)采用慢病毒感染分别构建HCT116与HT29的敲减及过表达的稳转细胞株(sh-cCSC1和oe-cCSC1组)及其空载慢病毒对照组(Cont组),用倒置荧光显微镜观察转染情况,QRT-PCR验证转染效率。用流式细胞仪检测干扰lncRNA-cCSC1表达后CD133~+CD44~+的比例变化,分别用Western blot和QRT-PCR检测两组细胞中干性标志物CD133、CD44、SOX2、CXCR4和Nanog的蛋白及mRNA表达量。采用细胞成球实验观察干扰lncRNA-cCSC1表达前后两组细胞中干细胞微球体形成的数量及大小上的差异,用细胞凋亡实验检测两组细胞对结直肠癌经典化疗药物5-FU敏感性的差异,用裸鼠皮下成瘤实验检测干扰lncRNA-cCSC1表达后所形成移植瘤的体积差异。4)采用基因富集分析(GSEA)方法检测lncRNA-cCSC1与经典干性通路富集情况。随后分别从Cont组、sh-cCSC1组及oe-cCSC1组中分选出CD133~+CD44~+细胞,用Western blot检测干扰lncRNA-cCSC1表达后对Hedgehog通路中关键蛋白Gli1和SMO表达量的影响;用SMO蛋白抑制剂Cyclopamine抑制Hedgehog通路活性后,用Western blot检测干性标志物CD133和CD44的蛋白表达量。结果:1)在TCGA数据库644例CRC患者数据中通过Limma共筛选出显著差异表达的基因1227个,其中mRNA 416个,miRNA 209个,lncRNA 602个。通过聚类分析及相关性矩阵分析筛选出干性相关的关键基因lncRNA-cCSC1,并与CD133(PROM1)、CD44、SOX2、CXCR4、Nanog等干性标志物显著相关。通过ensmble数据库进行比对,发现lncRNA-cCSC1位于12号染色体长臂24区第12带上。通过RACE实验验证lncRNA-cCSC1序列全长为2290bp,FISH实验结果显示lncRNA-cCSC1主要表达于细胞质中。经过4种不同的蛋白编码能力预测软件联合分析显示lncRNA-cCSC1不具备蛋白编码能力,符合lncRNA的特征。2)QRT-PCR结果显示lncRNA-cCSC1在结直肠癌组织中的表达显著高于癌旁正常组织(P<0.01),并且分析发现其表达丰度与肿瘤浸润程度、淋巴结转移及TNM分期显著相关(P<0.05),而与患者年龄、性别、肿瘤位置、大小、分化程度、血清肿瘤标志物水平等临床病理因素无显著相关性(P>0.05)。Kaplan-Meier生存分析显示高表达的lncRNA-cCSC1导致了患者一个较差的总体生存率(OS)及无病生存率(DFS)。此外,lncRNA-cCSC1的mRNA转录水平在结直肠癌细胞系中的表达显著高于人正常肠上皮细胞,且以HCT116及HT29两株细胞表达量最高。通过免疫磁珠法从这两株细胞中分选出的CD133~+CD44~+细胞比例为83.36%和90.93%,且在CD133~+CD44~+细胞及球细胞中lncRNA-cCSC1的表达丰度均明显高于CD133~-CD44~-细胞和贴壁细胞,P<0.05。3)通过荧光显微镜观察,在lncRNA-cCSC1敲减组(sh-cCSC1)和空载慢病毒组(Cont)中转染效率均大于90%,且经过QRT-PCR验证,sh-cCSC1组中的mRNA转录水平显著低于Cont组。敲低lncRNA-cCSC1后,与Cont组相比,sh-cCSC1组中的CD133~+CD44~+细胞比例显著降低,同时干细胞表面标志物CD133、CD44、SOX2、CXCR4和干细胞转录因子Nanog的蛋白表达丰度及mRNA转录水平均显著减少,所诱导形成的干细胞微球的数量也明显减少,CD133~+CD44~+细胞对化疗药物5-FU的敏感性显著增加,增殖、转移及侵袭能力减弱,形成裸鼠皮下移植瘤的体积显著变小,P<0.05。在lncRNA-cCSC1过表达组(oe-cCSC1)和空载慢病毒组(Cont)中,转染效率均大于90%,经QRT-PCR验证后,oe-cCSC1组中的mRNA转录水平显著高于Cont组。与Cont组相比,oe-cCSC1组中的CD133~+CD44~+细胞比例显著增高,干细胞表面标志物CD133、CD44、和干细胞转录因子Nanog的蛋白表达丰度显著增加,形成干细胞微球的数量也显著增加,P<0.05。4)GSEA分析表明靶向差异表达lncRNA-cCSC1后受影响的基因主要富集在Hedgehog信号通路。在分选出的CD133~+CD44~+细胞中,与Cont组相比,敲减lncRNA-cCSC1后,sh-cCSC1组的SMO和Gli1蛋白表达量显著降低;反之,过表达lncRNA-cCSC1后,oe-cCSC1组中的SMO和Gli1的蛋白表达量均显著增加,P<0.05。采用SMO蛋白抑制剂Cyclopamine处理后,与Cont组相比,抑制剂组的SMO和Gli1蛋白表达量显著降低,同时干细胞表面标志物CD133和CD44的蛋白表达量也随之降低,P<0.05。结论:LncRNA-cCSC1可能通过Hedgehog信号通路参与结直肠癌干细特性的调控,从而介导多种肿瘤生物学行为的改变。