近年来,伴随着牙种植技术的迅速发展,种植修复已成为缺牙患者所选择的主要修复方式之一,临床种植成功率可达到95%左右。但是,系统性骨疾病(如骨质疏松)患者仍存在骨形成能力弱、骨结合不良等现象,增加了种植失败的风险。在提高骨质疏松患者种植体骨结合的多种途径中,种植体的生物功能化被认为是一种极具前景的方法。酪蛋白激酶2相互作用蛋白1(Ckip-1)参与骨代谢,是成骨细胞分化和骨形成过程中至关重要的负调控因素,通过RNA干扰技术全身应用Ckip-1si RNA(si Ckip-1)对其进行基因沉默,能够提高骨质疏松条件下的骨形成。因此,采用si Ckip-1对种植体表面进行修饰有望促进种植体表面骨形成,从而提高骨质疏松患者的种植体成功率。本研究首先采用壳聚糖(CS)作为基因载体,通过静电作用与si Ckip-1形成CS/si Ckip-1复合物,将该复合物加载于碱热处理种植体表面,制备得到CS/si Ckip-1功能化的种植体,并对该种植体表面进行表面微观结构和表面性状分析;然后应用骨髓间充质干细胞,评价si Ckip-1的转染情况及该细胞在种植体表面的增殖和成骨分化水平;最后将种植体植入骨质疏松大鼠体内,初步探索该种植体在骨质疏松条件下早期骨结合能力。通过全面评价Ckip-1si RNA的作用,证实其在种植体表面应用的可行性,为骨质疏松种植体表面si RNA功能化修饰提供依据,为功能化种植体的表面设计提供指导。第一部分CS/siCkip-1功能化种植体的构建及表面性状分析【目的】构建CS/si Ckip-1功能化种植体并对其表面性状进行分析,为后续体内外实验提供模型。【方法】TA-CS/si Ckip-1种植体的制备:制备壳聚糖/Ckip-1siRNA(CS/si Ckip-1)复合物,马尔文激光粒度分析仪测量该复合物的粒径及zeta电位。纯钛种植体(PT)经过在Na OH溶液中加热处理,形成碱热处理钛(TA)。将CS/si Ckip-1复合物加载在TA表面,制备形成TA-CS/si Ckip-1种植体。TA-CS/si Ckip-1种植体的表面形状分析:扫描电镜(SEM)观察PT、TA和TA-CS/si Ckip-1表面微观形貌。Cy-3标记si Ckip-1,激光共聚焦逐层扫描观察si Ckip-1在试样表面分布情况。接触角系统获取液滴图像并测量各组试样表面接触角,评价试样表面亲水性。将试样浸入BSA蛋白24 h后使用BCA蛋白检测试剂盒测定试样表面蛋白吸附水平。【结果】壳聚糖和Ckip-1si RNA通过静电作用结合,形成CS/si Ckip-1复合物。该复合物粒径大小约为235.9±25.6 nm,zeta电位为+13.7±2.77 m V。碱热处理后形成TA,呈现多孔的纤维网状结构。CS/si Ckip-1复合物能够均匀的加载在TA种植体表面,还可进入到多孔结构内部,形成厚约2000 nm的si Ckip-1层。接触角测量结果显示,碱热处理使种植体亲水性增加,TA-CS/si Ckip-1亲水性低于TA组,但明显高于PT。对各组试样表面蛋白吸附进行定量,TA-CS/si Ckip-1组蛋白吸附量显著高于PT及TA组。【结论】壳聚糖和si Ckip-1能够在静电作用下形成粒径分布较一致、呈正电性的CS/si Ckip-1复合物。CS/si Ckip-1复合物能够均匀地加载在碱热处理后的种植体表面,构建出的TA-CS/si Ckip-1种植体表现出较高的亲水性和蛋白吸附水平。第二部分CS/si Ckip-1功能化种植体对大鼠骨髓间充质干细胞(r BMMSC)生物学行为的影响【目的】观察si Ckip-1的细胞转染情况,评价TA-CS/si Ckip-1种植体对r BMMSCs增殖及成骨分化能力的影响。【方法】全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,将细胞接种于TA-CS/si Ckip-1表面,培养48 h后激光共聚焦观察si Ckip-1的细胞转染情况。rBMMSCs接种1、4、7天后CCK-8法检测抛光组(PT)、碱热处理组(TA)、碱热处理-壳聚糖组(TA-CS)、碱热处理-壳聚糖/si RNA对照组(TA-CS/si NC)和碱热处理-壳聚糖/si Ckip-1组(TA-CS/si Ckip-1)试样表面细胞增殖情况,评价细胞活性。成骨诱导7、14、21天后分别检测试样表面碱性磷酸酶(ALP)表达、胶原分泌、细胞外基质(ECM)矿化水平,评价成骨分化能力。【结果】培养出r BMMSCs细胞形态及生长状态良好,选择2-4代细胞进行体外实验研究。细胞接种48 h后,在壳聚糖的保护和携带作用下,几乎所有的si Ckip-1转染进入r BMMSCs细胞内,分布于细胞核的周围。与PT组相比,TA、TA-CS、TA-CS/si NC和TA-CS/si Ckip-1促进了表面rBMMSCs细胞增殖,且这四组试样表面细胞增殖水平没有显著性差异。si Ckip-1在细胞内发挥RNA干扰作用,促进了ALP的表达、胶原分泌和细胞外基质矿化。【结论】CS/si Ckip-1功能化的种植体表现出良好的细胞生物相容性,si Ckip-1能够高效的转染入胞,促进r BMMSCs的成骨分化。第三部分CS/si Ckip-1功能化的种植体对骨质疏松大鼠骨结合效应的研究【目的】建立大鼠骨质疏松模型,探究TA-CS/si Ckip-1种植体植入后对骨质疏松条件下早期骨结合的影响。【方法】对雌性SD大鼠行双侧卵巢切除术,术后3个月后micro-CT扫描评价大鼠骨质疏松模型建立情况。将碱热处理(TA)、碱热处理-壳聚糖组(TA-CS)、碱热处理-壳聚糖/si RNA对照组(TA-CS/si NC)和碱热处理-壳聚糖/si Ckip-1组(TA-CS/si Ckip-1)植入骨质疏松大鼠双侧股骨。植入后不同时期(4 w、12 w)评价骨结合情况,具体方法如下:新生骨的Micro CT重建分析;组织学染色(VG染色)观察;骨-种植体界面元素扫描分析;机械力学测定(拔出实验)。【结果】双侧卵巢切除3个月后,Micro CT结果显示大鼠骨质疏松建立成功。种植体植入4周及12周后骨结合分析结果:Micro CT重建及定量分析可见,各组种植体周围均有新骨形成,TA-CS/si Ckip-1骨量最多且结构致密;组织学VG染色显示:TA-CS/si Ckip-1组新骨连续,与种植体紧密结合;对骨-种植体界面元素扫描,各组种植体表面新骨的组成结构类似于正常骨,且TA-CS/si Ckip-1组骨厚度显著高于其它组;各组种植体拔出力均随时间的延长而增大,TA-CS/si Ckip-1组在各个时间点最大拔出力和剪切强度均显著高于其它组。【结论】在骨质疏松条件下,TA-CS/si Ckip-1能够在体内发挥作用,在种植体周围形成早期、良好的骨结合。