microRNA是一类长度约22个碱基的内源性非编码小分子RNA,可以调控基因转录后的表达,它通过序列互补配对的方式对靶标mRNA的表达进行调控,具有广泛的基因调节功能,与一系列重要的生命过程密切相关。到目前为止,已经在动物、植物和病毒等众多物种中发现了三万多个miRNA,而且其数目还在迅速增长,家蚕（Bombyx mori）中已经发现567个miRNA（miRBase数据库）。miRNA已经成为基因表达调控研究的热点之一。研究家蚕幼虫不同龄期丝腺组织miRNA的表达差异及其调控的靶基因,对于更全面的了解丝腺发育过程及丝蛋白的产生有着重要的意义。本研究用深度测序的方法检测了家蚕后部丝腺中miRNAs表达,用实验方法验证了家蚕miRNAs对丝素、Bm-ase等基因表达的调控作用,为更深入对家蚕miRNA基因功能研究和阐明蚕丝蛋白基因表达调控机理奠定了基础。主要研究结果如下。1.家蚕4、5龄幼虫后部丝腺miRNAs的鉴定与表达分析家蚕幼虫5龄3-5d是丝蛋白合成的高峰期,为了研究家蚕幼虫不同时期后部丝腺中miRNAs表达差异,并作为研究家蚕miRNAs对丝素基因表达的调控作用的前期准备,我们委托测序公司,利用Solexa测序技术对家蚕（p50）4龄2d和5龄3d幼虫后部丝腺进行了sRNA（small RNA）测序,生物信息学分析显示,共检测到466个已知miRNAs,预测到35个新的miRNAs;对获得的499个miRNAs进行靶基因预测,获得到13,383个靶基因;家蚕4龄2d和5龄3d幼虫后部丝腺样品中,有29个miRNAs存在表达差异,推测这些差异表达家蚕miRNAs对蚕丝蛋白基因表达可能存在调控作用。但是,这些预测结果有待进一步实验验证。2.家蚕miRNAs对丝素基因表达的调控作用为了研究家蚕miRNAs对丝素基因表达的调控作用,我们从miRBase数据库（http://www.mirbase.org/）获得家蚕miRNAs,以家蚕丝素基因（Fib-H,Fib-L,P25）mRNA的3’UTR为靶基因,分别用RNA22（http://cbcsrv.watson.ibm.com/rna22.html）和RNAhybrid（http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid）靶基因在线软件预测可能对丝素基因有调控作用的家蚕miRNAs,获得在两套软件中都预测到的靶位点miRNAs,即bmo-mir-2739,bmo-mir-3237,bmo-mir-3366,bmo-mir-317等。分别构建了含荧光素酶报告基因和Fib-H、Fib-L和P25 3’UTR的靶基因载体,及bmo-mir-2739,bmo-mir-3237,bmo-mir-3366,bmo-mir-317等表达载体。用家蚕miRNA表达载体与对应的靶基因载体分别共转染BmN细胞,以转染p[IE-EGFP]的细胞为对照,48h后检测荧光素酶基因表达水平。结果显示,bmo-mir-2739提高了带有Fib-H 3’UTR载体的荧光素酶基因的表达,而不是通常的降低;bmo-mir-3237、bmo-mir-3366则能靶向调控P25的表达,其靶基因载体luc基因的表达被下调。用人工合成家蚕miRNA bmo-mir-2739、Bmo-miR-2998的模拟物,并与对应的靶基因载体分别共转染BmN细胞,结果显示,bmo-mir-2739靶向调控Fib-H的表达,荧光素酶活性也提高了,Bmo-miR-2998靶向调控Fib-L的表达,降低了luc的活性。3.家蚕mir-9a对Bm-ase基因表达的调控作用Bm-ase基因是神经前体细胞中一种重要的基因,主要在神经前体细胞中表达,属于asense基因。以Bm-ase为靶基因,用同样的靶基因预测软件预测出Bm-ase可能是bmo-mir-9a、bmo-mir-3223、bmo-mir-2845和bmo-mir-745*的靶基因。为了验证预测结果,我们构建了含荧光素酶报告基因和Bm-ase 3’UTR的靶基因载体;bmo-mir-9a、bmo-mir-3223、bmo-mir-2845和bmo-mir-745*的miRNA表达载体,miRNA表达载体与含Bm-ase 3’UTR的靶基因载体分别共转染,以转染p[IE-EGFP]的细胞为对照,48h后检测荧光素酶基因表达水平。结果显示,含Bm-ase 3’UTR的靶基因载体的荧光素酶活性被bmo-mir-9a降低了。为了进一步验证bmo-mir-9a对Bm-ase表达的调控作用,我们人工合成了bmo-mir-9a的miRNA的模拟物,与含Bm-ase 3’UTR的靶基因载体共转染,检测结果显示,bmo-mir-9a mimics同样也使靶基因载体的荧光素酶活性降低了。说明bmo-mir-9a能抑制Bm-ase的表达。