研究背景近年,医用臭氧(ozone, O3)注射技术在疼痛临床中均显示了良好的应用前景。臭氧是氧分子的同素异形体,具有极强的氧化分解杀菌消毒能力。臭氧依靠与生物大分子反应生成的活性氧(ROS)和脂质过氧化产物(LOPs)产生治疗作用,但ROS和LOPs一旦超出机体的抗氧化能力,则会导致机体的过氧化损伤。目前臭氧治疗的浓度及剂量国内外尚未形成统一的标准。相关研究将不同浓度(30,50,80μg/ml)的医用臭氧经小脑延髓池注入兔蛛网膜下腔,结果表明鞘内注射较高浓度(50,80μg/ml)医用臭氧对脊髓造成过氧化损伤作用,且损伤程度与臭氧浓度有量效关系；同时在较高浓度(40,60μg/ml)臭氧作用下星形胶质细胞细胞形态明显受损,细胞膜通透性增加,表现在乳酸脱氢酶(LDH)漏出率增加、细胞内脂质过氧化产物丙二醛(MDA)水平升高。过氧化损伤是多因素、多环节的级联过程,而细胞凋亡是导致神经细胞过氧化损伤的主要机制之一。凋亡是多基因严格控制的过程。凋亡因子Bax和抗凋亡因子Bcl-2及二者的比例对细胞的生存和死亡具有重要的调控作用。脊髓损伤后,电镜下可观察到枕叶皮质线粒体及内质网肿胀呈空泡样,脊髓呈现神经结构性损伤及Bcl-2,Bax的表达变化。细胞凋亡具有独特而复杂的信号系统,其发生过程的启动和进行受到精确调控,其中JNK/MAPK通路可被炎症、应激和损伤启动的信号激活并介导细胞凋亡信号的转导,激活的JNK通路可调控凋亡相关基因家族成员的差异性表达：如Bax的表达上调和Bcl-2的表达下调。机体在受到外界伤害性刺激时,会自发进行保护性免疫应答。氧化应激所激活的脂质过氧化反应可进一步活化机体免疫反应的发生。Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)在针对病原体入侵的防守中发挥重要作用,能够特异性识别病原相关的分子模式(Pathogen associated molecular patterns, PAMPs),不仅可以激活固有免疫,而且可以调节获得性免疫。作为脂多糖LPS (lipopolysaccharide)的主要识别受体,Toll样受体4(Toll-like receptor4, TLR4)可进一步识别(?)LPS激活靶细胞诱导产生的炎性因子(女(?)TNF-α、IL-6等)。TLRs的适当激活有利于机体抵抗过氧化损伤,过度激活所引起的持续性免疫反应也会给机体带来不利影响,在LPS持续刺激下TLR4可介导败血病和感染性休克的发生,因此TLRs的激活必须受到严密的负向调控,以保持机体免疫的相对稳定。泛素化过程是蛋白质翻译后修饰(post-translational modifications, PTM)的一种形式,调节多种细胞生物学过程。泛素化作用是细胞内存在的负向调控因子抑制或终止信号蛋白表达的主要机制之一。泛素化经泛素标记后的蛋白质经特异性识别后降解,在细胞的抗原呈递及炎症反应等占有重要地位,其中泛素连接酶E3(ubiquitin-protein ligase E3)在泛素化修饰中具有中心作用。有研究表明,WW结构域的E3泛素蛋白连接酶1WWP1(WW domain containing E3ubiquitin protein ligase1)可能参与机体炎症反应的过程,炎性因子TNF-a可诱导WWP1的产生。同时,LPS-TLR4介导的炎性反应能够诱导机体的固有免疫反应,而WWP1通过拮抗DAF-2胰岛素信号转导通路进而调节机体的固有免疫。转化生长因子TGF-β (transforming growth factor p)可诱导WWP1的表达水平升高,可能与WWP1抑制TGF-p的负反馈调节作用有关；而TGF-p所介导的抗炎反与LPS-TLR4所介导的炎性反应之间的平衡在机体许多炎性疾病中发挥了重要作用。经研究证实TLR4受体的表达受TGF-p的调控,但WWP1是否参与TLR4受体表达的负向调控尚无有关研究。医用臭氧可导致脊髓过氧化损伤,其损伤机制与神经细胞凋亡有关,而MAPK信号通路是导致细胞凋亡发生的重要通路之一。目前WWP1参与机体炎性反应的机制研究尚少,是否与机体免疫应答的负向调控有关有待进一步阐明。目的本研究通过体外和体内实验观察不同浓度(20,40,60μg/ml)医用臭氧对神经细胞和脊髓组织JNK/MAPK信号转导通路的影响,着重从细胞凋亡角度探讨JNK/MAPK信号转导通路在医用臭氧的脊髓毒性作用机制的可能影响；通过观察WWP1的过度表达或沉默对LPS所诱导的各通路蛋白和炎性因子表达的影响,着重从Toll样受体泛素化角度探讨WWP1对LPS-TLR4所介导的MyD88信号依赖通路的可能调节机制。方法1.观察不同浓度(20,40,60μ/ml)医用臭氧对神经细胞的细胞损伤作用原代大鼠脊髓神经元细胞进行MAP-2免疫荧光鉴定后观察不同浓度臭氧干预下细胞形态学的改变Hoechst33258荧光染色法观察细胞和损伤。全细胞膜片钳观察低浓度(15,20μg/ml)臭氧对神经元钙电流的影响。MTT和流式细胞技术检测脊髓神经元和PC12的细胞活力。RT-PCR和、Western blotting法检测细胞内Bax和Bcl-2的表达。2.不同浓度医用臭氧作用下神经细胞MAPK信号转导通路的表达变化Western blotting法检测不同浓度臭氧(20,40,60μg/ml)作用24h后神经细胞内JNK, p-JNK, ERK和p-ERK的表达。3.JNK抑制剂对不同浓度医用臭氧诱导神经细胞凋亡的影响神经细胞加入JNK特异性抑制剂AS601245(0.1μM)预处理40min,分别进行20,40,60μg/ml臭氧干预。Western blotting检测.INK和p-JNK蛋白水平表达的变化,MTT和流式细胞技术检测神经细胞活力,RT-PCR和Western blotting检测细胞内Bax和Bcl-2的表达。4.大鼠鞘内注射模型的建立,观察不同浓度(20,40,60μg／ml)医用臭氧干预后大鼠脊髓组织细胞凋亡的程度及JNK/MAPK信号转导通路的表达变化。不同浓度臭氧干预24h后,采用BBB评分进行动物神经行为学评价。RT-PCR和Western blotting法检测凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达；Western blotting法检测JNK和ERK蛋白的表达。尾静脉给予AS601245(4.5mg/kg)6h后鞘内注射不同浓度臭氧,注射24h后对大鼠后肢运动功能进行评价,并分别检测大鼠脊髓组织中Bax、Bcl-2、JNK、 p-JNK、ERK及p-ERK的表达。5.观察WWP1对LPS或TNF-a所诱导的炎性反应的影响通过SiRNA干扰／质粒转染技术使腹腔巨噬／RAW264.7细胞内WWP1沉默或过度表达(野生型和突变型),ELISA和RT-PCR检测LPS或TNF-a刺激下细胞中TNF-α和IL-6的分泌和表达,Western blotting检测IRF3、NF-κB和MAPK各通路(JNK、ERK、P38)的蛋白表达。6.研究WWP1对LPS-TLR4激活的MyD88信号依赖通路的可能作用位点采用质粒转染技术将已标记的TRAF6和IRAKI分别与WWP1转染HEK293T细胞后,免疫共沉淀技术检测WWP1分别与TRAF6和IRAK1的相关性。Western blotting法检测WWP1作用下TRAF6和ITAK1的蛋白表达变化,加入蛋白酶抑制剂MG132后检测TRAF6的蛋白表达变化。通过SiRNA干扰／质粒转染技术使腹腔巨噬／RAW264.7细胞内WWP1沉默或过度表达(野生型和突变型),Western blotting检测TRAF6和ITAK1的表达及LPS刺激下TRAF6的泛素化与K48或K63聚泛素化的关系。7.体内实验进一步观察WWP1沉默对LPS所诱导的小鼠肺损伤的保护作用采用SiRNA干扰技术使小鼠体内WWP1沉默后,通过LPS刺激建立内毒素休克模型,ELISA法测定小鼠血清中TNF-a和IL-6的分泌,肺组织化学染色法观察小鼠肺组织的损伤程度。结果1.不同浓度医用臭氧的脊髓毒性作用及机制的体外研究不同浓度(20,40,60μg/ml)臭氧作用后光镜下可见神经细胞内大疱形成,神经突起扭曲断裂,Hoechst33258染核后,细胞核高亮浓缩,出现核碎裂及核固缩,该效应与臭氧浓度呈正相关。与对照组相比,较低浓度臭氧(15,20μg/ml)可使神经细胞钙内流增加(P<0.05),激活电压向超极化方向移动(P<0.05)；三组钙电流稳态失活曲线均无显著性差异(P>0.05)。与对照组及较低浓度臭氧20μg/ml组相比,60μg/ml臭氧组能够显著抑制神经细胞的存活率(P<0.01)；与对照组相比,40μg/ml臭氧组可观察到大量凋亡的神经细胞。RT-PCR和Western blotting结果均显示各臭氧组较对照组神经细胞内凋亡蛋白Bax表达明显升高(60ng/ml, P<0.01),且具有浓度依赖性,但抗凋亡蛋白Bcl-2表达无明显差异(P>0.05)。各臭氧组磷酸化JNK蛋白表达与Bax表达水平具有类似趋势(60μg/ml, P<0.01), AS601245预处理后可明显抑制较高浓度(4μg/mlO3)臭氧所诱导的细胞凋亡(P<0.05),显著降低磷酸化JNK和Bax蛋白的表达水平(P<0.01)。2.不同浓度医用臭氧的脊髓毒性作用及机制的体内研究与对照组相比,鞘内注射不同浓度(20,40,60μg/ml)臭氧后,较高浓度(40,60μg/ml)臭氧组注射后BBB评分与对照组相比明显降低,且60μg/ml臭氧组脊髓损伤更明显(P<0.01)；凋亡蛋白Bax的表达水平随着臭氧干预浓度的增加而升高(P<0.01)；抗凋亡蛋白Bcl-2表达无统计学差异(P>0.05)。Western blotting结果显示p-JNK/MAPK活力随着臭氧浓度升高而明显增加(60μg/ml, P<0.01),尾静脉给予AS601245预处理后,各臭氧组大鼠BBB评分均有所改善(P<0.05),各组p-JNK/MAPK活力明显降低(P<0.01),较高浓度臭氧组(40μg/ml) Bax的表达水平明显降低(P<0.01)。3. WWP1明显抑制LPS而非TNF-a刺激下TNF-a和IL-6的表达Lesh WWP1+LPS组的腹腔巨噬细胞TNF-α和IL-6的表达水平明显增加(P<0.01),而Lesh NC各组及Lesh WWP1+TNF-α组未见明显差异(P>0.05)；His-WWP1+LPS组的RAW264.7细胞TNF-α和IL-6的表达水平明显降低(P<0.01),而His-Control各组及His-WWP1+TNF-α组及His-C890A各组无明显变化(P>0.05)；与Lesh NC+LPS组相比,Lesh WWP1+LPS组小鼠血清中TNF-a和IL-6的表达均增加(P<0.01)；同时Lesh WWP1+LPS组小鼠的肺组织学分析呈现出更为严重的肺损伤。4. WWP1抑制LPS诱导下IκB-α, NF-κB及MAPK的活化,而与IRF3的表达无关与Lesh NC组相比,Lesh WWP1组中p-IκB-α、p-65、p-JNK、p-ERK、p-P38活力明显增加,以LPS刺激后90min增加最明显,而IRF3的表达无明显统计学差异；与His-Control组及His-C890A组相比,His-WWPl组中P-IκB-α、p-65、 p-JNK、p-ERK、p-P38活力明显降低,而对IRF3的表达无明显影响。5. WWP1对TRAF6而非IRAK1具有明显的蛋白酶体降解作用His-WWP1与Myc-TRAF6组出现蛋白共沉淀现象,而与IRAK1无关；His-WWPl和His-C890A两组均与myc-TRAF6出现免疫共沉淀现象；LPS刺激后(30,60min)出现WWP1与TRAF免疫共沉淀现象；Myc-TRAF6+His-WWP1组中TRAF6的蛋白表达明显降低,而WWP1野生型对TRAF6的降解作用可被MG132缓解,myc-TRAF6+His-C890A组中TRAF6的蛋白表达无明显变化；与Lesh NC组相比,Lesh WWP1组TRAF6的蛋白表达明显增加,且LPS刺激120min后更明显；Myc-TRAF6+His-WWP1组中TRAF6的蛋白表达明显降低,而His-C890A组TRAF6表达无明显变化。6. WWP1基因的沉默降低LPS诱导下TRAF6的K48而非K63相关的泛素化Lesh NC组TRAF6在LPS刺激下均发生K48及K63相关的泛素化,而LeshWWP1组细胞中TRAF6在LPS刺激60min后只发生K48相关的泛素化。结论1.医用臭氧对神经细胞具有过氧化损伤作用,较高浓度臭氧(40,60μξg/ml)可降低神经细胞的存活率,诱导细胞钙离子内流增加,增加凋亡蛋白Bax的表达；鞘内注射臭氧可明显降低大鼠后肢运动功能评分,使脊髓组织中的Bax蛋白过度表达,且具有浓度依赖性。2.较高浓度臭氧(40,60μg/ml)干预后可增加神经细胞和脊髓组织的磷酸化JNK蛋白水平,JNK抑制剂预处理后可明显降低臭氧引起的神经系统的过氧化损伤,降低细胞凋亡率,改善运动功能评分。3.医用臭氧通过JNK/MAPK信号转导通路调节Bax蛋白的表达介导脊髓神经系统过氧化损伤。4. WWP1对LPS所诱导的炎性因子TNF-a和IL-6的表达具有抑制作用5. WWP1对TRAF6的蛋白降解作用与K48聚泛素化相关6. WWP1通过TRAF6的蛋白酶体降解作用负向调节TLR4介导的TNF-a和IL-6的表达