研究背景:疼痛给现代人类带来了巨大的痛苦,严重影响了人们的生活质量。慢性疼痛是许多慢性疾病的常见伴随症状,目前就世界范围来看,慢性疼痛的患者远远多于患有糖尿病、心脏病以及癌症的患者。然而,由于慢性疼痛的发病机制复杂,包括了炎性因素、神经或组织损伤因素等,因此,临床上对于预防和治疗慢性疼痛尚缺乏安全有效的的治疗方法。根据世界卫生组织(WHO)的推荐,中到重度的慢性疼痛,如癌症所导致慢性疼痛,其治疗药物还是首选吗啡或芬太尼等阿片类药物。阿片类药物是目前临床上最常用的且最为有效的一类镇痛药物。然而,长期多次使用阿片类药物不仅会产生很多副作用,如便秘、瘙痒、呼吸抑制等,而且不可避免的会产生药物耐受,使阿片类药物的镇痛作用逐渐降低,还有可能完全消失,甚至还会产生阿片药物导致的痛觉过敏。而临床治疗为了达到原有的镇痛作用,不得不逐渐加大药物的剂量,这无疑又会增加药物的副作用和不良反应,甚至导致药物成瘾的产生。那么,如何才能最大程度的充分发挥阿片类药物的镇痛作用,同时又能有效地避免阿片类药物产生药物耐受、成瘾等不良反应呢?这个问题是目前全球的科研工作者和临床专家所密切关注的一个热点问题。但由于阿片类药物所导致的药物耐受、成瘾的发生机制还不明确,至今仍没有一种治疗方法能有效的避免阿片类药物耐受成瘾的产生,这很大程度地限制了阿片类镇痛药物在临床上的使用,从而降低了急慢性疼痛患者的生活质量。本研究阐明阿片类药物耐受、成瘾的发生发展机制,探索有效的预防和治疗慢性疼痛的治疗方法,从而提高慢性疼痛患者的生活质量,尤其是中到重度的慢性疼痛患者的生活质量,这是目前全球非常紧迫的科研和医疗任务。然而不幸的是,由于吗啡耐受的发生机制非常复杂,至今尚不清楚,因此,临床上目前尚无有效的治疗办法能对其进行有效预防或治疗。本研究旨在为探寻吗啡耐受机制提供一个新的思路,为吗啡耐受的治疗提供一个新的靶标。实验主要分为三部分,通过行为学检测、分子生物学检测等手段,初步探讨Shh信号通路在吗啡耐受的发生发展过程中的表达变化及其规律,以及调控吗啡耐受的可能机制。第一部分 Shh信号通路在吗啡耐受过程中的表达与分布目的:通过建立慢性吗啡耐受模型,探讨在吗啡耐受过程中,脊髓和背根神经节中Shh信号通路的表达变化规律,以及这种时空变化规律与吗啡耐受的行为学的关系。方法:选择成年雄性C57小鼠,体重(22-24克),8-10周龄,采用数字表法随机分为两组:对照组(Sham组)和吗啡组(Mor组),Mor组根据不同的时间点又分为若干亚组,每组8只小鼠。参照相关文献,反复在小鼠皮下注射10mg/kg的吗啡,连续7天,每天一次,建立慢性吗啡耐受模型。对照组分别在同一的时间点注射相同体积的生理盐水。在每次注射后2小时,利用热板法和热刺激法测定吗啡最大镇痛效果(MPE%)和小鼠的热缩足阈值变化。每天测一次,连续测7天。并在不同的时间点(第1,3,5,7天)亚组,在测定行为学变化后,断头处死实验动物,快速取出小鼠L4-L6节段的脊髓组织以及小鼠双侧的背根神经节(DRG),利用western blot技术检测其中Shh信号通路重要蛋白分子(胞浆内的Shh、Ptch1、Smo以及细胞核内的Glil)的表达变化。同时,利用免疫荧光双标技术,进一步明确增多的Shh在脊髓的细胞学定位。因为Shh蛋白是一种分泌性的蛋白,只有被分泌出来才能发挥作用,因此,我们又采用ELISA技术,检测了脊髓组织和DRG中Shh的浓度变化,以反应Shh的分泌情况。结果:反复注射吗啡后,实验动物逐渐表现出吗啡耐受现象。随着吗啡的反复注射,吗啡的最大镇痛效应(MPE%)逐渐降低,在吗啡注射后的第三天出现显著性的下降(P<0.05),到连续吗啡注射后的第7天,不仅MPE%显著降低,而且实验小鼠还逐渐表现出明显的热缩足反应并且阈值显著性降低(P<0.05)。随后,我们通过western blot检测发现,脊髓组织和DRG组织中的Shh及其受体Ptch1和Smo,随着吗啡的反复注射,其表达呈时间依赖性的逐渐升高,而且其变化的趋势与MPE%和热缩足阈值的下降在时间上也呈明显的一致性。除此之外,随着吗啡的反复注射,细胞核内Gli1的表达也呈时间依赖性的逐渐增多,提示Shh信号通路的活化逐渐增强。同时,ELISA结果显示,反复注射吗啡后,脊髓组织和DRG组织中,Shh蛋白分子的浓度显著提高,提示大量的Shh蛋白被分泌出来。进一步,又通过免疫荧光技术,我们发现,在DRG组织中,增多的Shh主要表达在与伤害性信息传递相关的中神经元和小神经元上,同样,在脊髓背角中,增多的Shh主要表达在接受伤害性信息传递的Ⅰ-Ⅱ板层以及接受伤害性信息传递的V-VI板层。通过免疫荧光双标进行细胞学定位,发现Shh主要表达在神经元以及星形胶质细胞上,而在小胶质细胞上几乎不表达。结论:反复注射吗啡可诱导脊髓背角和DRG中Shh信号通路表达增多,活化增强;增多的Shh主要表达在神经元和星形胶质细胞上。第二部分 抑制Shh信号传导通路对吗啡耐受行为学和脊髓中神经化学变化的影响目的:利用外源性药物或siRNA抑制或干扰Shh信号通路,来观察阻断该信号通路对吗啡耐受行为学变化和神经化学变化,以证实该信号通路在吗啡耐受中的作用。方法:选择成年雄性C57小鼠,体重(22-24克),8-10周龄,随机分为4组:Mor组(反复皮下注射吗啡,每天两次,连续7天),Sham组(皮下注射等体积的生理盐水),CLP+Mor组(腹腔注射cyclopamine在吗啡耐受模型组的不同的时间点,一天一次,连续3天,详见正文部分),DMSO+Mor组(在吗啡耐受模型组的不同时间点,注射与CLP等体积的DMSO溶剂),每组10只小鼠。为了进一步证实Shh信号通路的作用,我们还采用了 Shh信号通路的小干扰RNA,ShhsiRNA,同时以乱序列RNA,control siRNA(con-siRNA)作为对照。在注射吗啡前3天,鞘内注射Shh siRNA(1μg/10ul,每天1次,连续3天)。主要利用行为学技术和分子生物学技术,检测干扰Shh信号通路对吗啡耐受的行为学变化和脊髓中神经化学变化的影响。结果:在反复吗啡注射的第1,2,3天(早期),提前腹腔注射CLP(10mg/kg,一天一次,连续3天),能显著的推迟吗啡耐受的产生并缓解吗啡耐受的程度。MPE%开始下降的时间显著推迟(从第3天推迟到第5-6天),下降的幅度显著降低(P<0.05)。同时,小鼠出现热缩足阈值下降的时间亦显著推迟,下降的幅度也显著降低(P<0.05)。然而,在反复吗啡注射的第5,6,7天(晚期)再给予CLP,对已产生的MPE%下降和热缩足阈值下降无明显影响(P>0.05)。为了进一步验证这一结果,我们使用的生物干扰制剂Shh siRNA。与药物抑制类似,提前注射Shh siRNA后,反复注射吗啡导致的吗啡耐受被显著的推迟和缓解,MPE%的下降速度和幅度均明显减小(P<0.05)。同时,分子生物学检测结果表明,反复注射吗啡后,脊髓背角c-fos蛋白和CGRP蛋白的表达均显著增高,提前注射cyclopamine(第1,2,3天)抑制Shh信号通路,能显著抑制反复吗啡注射导致的脊髓背角c-fos和CGRP的表达上调。结论:抑制Shh经典通路能有效地抑制吗啡耐受并能抑制吗啡导致的痛觉过敏反应的产生,但对已经产生的吗啡耐受无明显作用。阻断Shh信号通路能抑制吗啡耐受导致的脊髓组织中神经化学的改变。第三部分 Shh信号通路通过上调脑源性神经营养因子(BDNF)参与对吗啡耐受的调控目的:使用Shh信号传导通路的抑制剂和激动剂以及BDNF的抑制剂和中和抗体,来进一步探讨Shh信号传导通路调控吗啡可能的作用机制。方法:参照文献,首先在吗啡耐受模型上,分别注射Shh药物抑制剂CLP和小干扰RNAShhsiRNA(给药方法同第二部分),利用分子生物学技术,检测脊髓组织中BDNF蛋白的表达情况(n=6)。另外,在正常的小鼠中,外源性给予Shh信号通路激动剂SAG(5mg/kg,i.p.),利用分子生物学技术和行为学技术,检测激活Shh信号通路对脊髓中BDNF表达的影响,以及对小鼠热缩足阈值的影响。最后,在吗啡耐受模型中,分别注射BDNF的抑制剂K252(80μg/kg,i.t.)或BDNF中和抗体anti-BDNF(2μg/kg,i.t.),利用行为学检测抑制BDNF对吗啡耐受的影响,同时,利用免疫荧光双标技术,检测BDNF与Shh信号通路之间的关系。结果:western blot结果显示,在反复注射吗啡后,脊髓组织中BDNF蛋白的表达呈时间依赖性的逐渐升高。从反复吗啡注射后的第3天开始显著升高(P<0.05),第5-7天达到高峰。应用CLP或Shh siRNA抑制Shh信号通路,能有效抑制反复吗啡注射导致的脊髓组织中BDNF的表达上调。在正常动物中,外源性注射Shh信号通路激动剂SAG能快速(注射后1小时)的诱导脊髓组织中BDNF的表达上调,而这一作用可以被CLP所抑制。此外,在正常动物中注射SAG能明显的导致实验动物的热缩足阈值降低(P<0.05),而SAG的这一作用可以被K252或anti-BDNF所逆转。此外,早期给予BDNF抑制剂K252或anti-BDNF(每天一次,连续3天),能有效的推迟吗啡耐受和MIH的产生。同时,MPE%和热缩足阈值降低的幅度也显著减小。免疫荧光双标证实,在脊髓背角,增多的BDNF分别于Shh蛋白以及Gli1蛋白有共表达的现象。结论:反复注射吗啡会导致脊髓组织中BDNF的表达上调,抑制BDNF能有效推迟和缓解吗啡耐受的产生。BDNF可能是Shh信号通路下游的靶蛋白,Shh信号通路对吗啡耐受的调控可能是通过上调脊髓组织BDNF来实现的。