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植物中存在着控制和应答氧水平的敏感体系,从而维持稳定的氧水平,这对于避免不必要的能量丧失以及植物稳定生长至关重要。已知透明颤菌能合成血红蛋白以适应在贫氧环境生活,而该蛋白在大肠杆菌中的表达也明显促进了细胞在微氧条件下的生长和蛋白质合成能力。因此,将透明颤菌血红蛋白基因转入烟草,研究该基因对植物代谢水平和植物生长的影响,尝试通过基因工程技术增加转基因作物产量。 根据透明颤菌血红蛋白(VHb)的氨基酸序列,按照植物偏爱密码子,对透明颤菌血红蛋白基因(vgb)进行优化改造,同时考虑到可实现分别克隆拼接的酶切位点,设计并合成了22条寡核苷酸片段,分3个小片段分别退火、克隆,通过拼接获得改造的全长450bp的透明颤菌血红蛋白基因vgbM,并将其克隆至pUC19上,获得重组质粒pGSVHB。 利用设计的引物,通过PCR在vgbM基因的5’-端引入Nco Ⅰ位点,然后将其克隆到原核生物高效表达载体pBV221上,构建成重组表达载体pBV221SVHB。将表达载体pBV221SVHB转化大肠杆菌菌株BL21,经热激诱导,在培养物中检测到了约16kD具有生物活性的VHb蛋白。通过测定分别转化了pBV221、pBV221SVHB的大肠杆菌菌株在VHb诱导表达前后培养液的OD600值,并绘制其生长曲线,结果表明:与对照菌株相比,重组大肠杆菌在VHb表达之后生长有所加快。 将pGSVHB中的vgbM基因克隆到中间载体pG4AB上,构建成带有35S启动子和NOS终止子以及Ω、Kozak增强表达的调控元件的中间载体pG4ASVHB。再将此完整的表达盒克隆至植物表达载体pBI121.1上,从而获得vgbM基因的高效植物表达载体pGBI4ASVHB。通过农杆菌介导法,获得了60株转vgbM基因的烟草植株,其中有40株表现出生长量增加。经PCR、Southern blot、Western blot等分子生物学方法分析,证明透明颤菌血红蛋白基因(vgbM)已整合到烟草基因组中,并成功地表达出16kD的VHb蛋白。与野生型对照相比,转VHb基因的烟草生长量明显增加,同时代谢物产量发生变化:在生长了60天之后,表达VHb的转基因烟草植株比对照植株相同部位叶片的平均鲜重增加266%以上;同时,转基因植株比对照植株多含有20.3-23.4%叶绿素;转基因植株比对照植株的开花结实数高117%-277%。