【摘 要】
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在真核细胞中,遗传信息储存在DNA中并且以核小体为基本单位装载在染色质中。H2A.Z是存在于酵母和人细胞中的H2A一个高度保守的变体,它在染色质中的存在被认为与基因转录调控、DNA损伤修复、基因组稳定性相关。将组蛋白变体置换进、出染色质是染色质重塑中非常重要的组成部分。已经有很多发表的论文中报导了一些具有H2A.Z置换功能的酶。酵母中Swr1和它在人细胞中的两个同源物SRCAP和P400/TIP6
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在真核细胞中,遗传信息储存在DNA中并且以核小体为基本单位装载在染色质中。H2A.Z是存在于酵母和人细胞中的H2A一个高度保守的变体,它在染色质中的存在被认为与基因转录调控、DNA损伤修复、基因组稳定性相关。将组蛋白变体置换进、出染色质是染色质重塑中非常重要的组成部分。已经有很多发表的论文中报导了一些具有H2A.Z置换功能的酶。酵母中Swr1和它在人细胞中的两个同源物SRCAP和P400/TIP60是已经比较清楚的被证实的具有活性的染色质重塑酶。最近的研究表明,H2A..Z可以被TIP60置换进DSB（DNA双链断裂）位点,而不依赖于TIP60的乙酰基转移酶活性。H2A.Z缺失会导致非同源末端连接（NHEJ）复合物KU70/KU80无法募集到DSB部位,使DSB的修复过程无法继续。H2A.Z被置换进核小体是发挥了基因转录激活亦或抑制作用还不十分清楚,但是H2A.Z在promoter区临近核小体的存在会导致DNA对于RNA聚合酶可接近性的改变,从而能影响基因转录。另外,H2A.Z在DSB损伤修复中也起着非常重要的作用。为了筛选其它并没有被发现可能具有H2A.Z置换功能的蛋白组分,我们将100LHeLa细胞核抽出物蛋白进过多次柱层析分离,并应用体外组蛋白变体置换实验跟踪置换活性。我们发现了能够将H2A.Z置换进核小体的蛋白活性组分,之后我们进一步在体内、体外实验中证实该蛋白组分的H2A.Z置换活性及其相关特性。蛋白质谱结果显示活性组分中富含DNA-PKcs和condensin complexⅡ的所有亚基的肽段。在之后进行的亲水一疏水层析中,这两个蛋白组分的募集峰分开了,并且蛋白峰的体外H2A.Z置换活性主要存在于DNA-PKcs的组分中。进一步的实验发现,体外纯化的condensin复合物没有H2A.Z的置换活性,说明具有H2A.Z置换活性的蛋白是DNA-PKcs。另外,利用从细胞中纯化的DNA-PKcs蛋白也证实其具有体外H2A.Z置换活性,并且随着DNA-PKcs的添加量的增加,置换活性也逐渐增加。由于H2A.Z在DNA双链断裂之后在损伤位点附近有募集,我们在两种损伤细胞模型中敲低DNA-PKcs观察其对H2A.Z募集的影响。在X射线辐射模型中,H2A.Z在1h左右有募集,敲低DNA-PKcs能够导致H2A.Z募集峰丰度降低和滞后。在40HT诱导的DNA双链断裂模型中,敲低DNA-PKcs可以导致H2A.Z在DSB部位的募集明显滞后（滞后了 2h）。接下来我们对DNA-PKcs调控H2A.Z置换的分子机制进行了研究,发现DNA-PKcs可能是通过磷酸化H2A,改变染色质结构,进而将H2A.Z置换入染色质中,并且这种活性能被DNA-PKcs的激酶抑制剂NU7026所抑制。但是DNA-PKcs在此过程中有没有磷酸化其它蛋白,以及H2A被DNA-PKcs磷酸化的位点等,还有待进一步验证。综上所述,我们认为DNA-PKcs是一种新的具有将H2A.Z置换入核小体功能的蛋白,这种置换活性与其对H2A的磷酸化相关,但它具体的作用机制仍有待进一步的研究。
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