本研究旨在探讨应用NT-3基因修饰雪旺细胞和NT-3受体基因修饰神经干细胞联合移植治疗大鼠全横断脊髓损伤，观察这种治疗策略能否更好地促进受损伤脊髓结构和功能的恢复，并分析其中可能的作用机制，为临床治疗急性脊髓损伤提供新策略及其实验依据。本研究共分为以下四个部分： 第一部分人神经营养素．3基因重组腺病毒载体的构建、表达和生物活性检测 目的：构建具有生物活性的人神经营养素-3(neurotrophin-3，NT-3)基因重组腺病毒表达载体。 方法：从人脑组织mRNA中扩增NT-3基因全长cDNA，定向克隆于穿梭质粒pShuttle中，获得一个带有CMV启动子的表达盒。再与腺病毒骨架DNA(Adeno-X viral DNA)体外连接，形成重组腺病毒质粒(pAd-NT-3)。用pAd-NT-3转染人胚肾293细胞后包装成有感染能力的重组腺病毒颗粒(Ad-NT-3)。 结果：NT-3基因RT-PCR扩增产物大小约801bp。Ad-NT-3 PCR鉴定为正确重组子。RT-PCR、免疫细胞化学、EUSA及Wlestem blot检测显示Ad-NT-3能够在其转染的293细胞表达和分泌NT-3。这种NT-3能使体外培养的神经干细胞更多地分化为神经元样细胞。 结论：应用体外连接法成功构建了人NT-3基因重组腺病毒表达载体，其表达产物具有促进神经干细胞分化为神经元样细胞活性作用。 第二部分NT-3受体TrkC基因重组腺病毒载体的构建、表达及生物学活性检测 目的：构建人NT-3受体TrkC基因重组的腺病毒表达载体(Ad-TrkC)，并探讨Ad-TrkC介导的TrkC基因在神经干细胞内的表达及其对神经干细胞的生物活性作用。 方法：从人脑组织mRNA中扩增TrkC基因全长cDNA，定向克隆于穿梭质粒pShuttle中，获得一个带有CMV启动子的表达盒。再将表达盒与腺病毒骨架DNA(Ad-X viral DNA)体外连接，形成重组腺病毒质粒(pAd-TrkC)。用pAd-TrkC转染人胚肾293细胞后包装成有感染能力的重组腺病毒颗粒(Ad-TrkC)。用RT-PCR检测Ad-TrkC感染的神经干细胞的TrkC mRNA含量。用免疫细胞化学和Western blot检测Ad-TrkC感染的神经干细胞TrkC受体蛋白水平。在体外培养条件下，观察人NT-3对感染了Ad-TrkC的神经干细胞分化为神经元样细胞和星形胶质样细胞的影响。 结果：TrkC基因RT-PCR扩增产物为2478bp。Ad-TrkC经PCR鉴定为正确重组子。在Ad-TrkC感染的神经干细胞中检测到TrkC mRNA和TrkC受体蛋白，且表达产物和其配体NT-3结合后能使体外培养的神经干细胞更多地分化为神经元样细胞，分化率达到55.2％，均高于其它对照组。 结论：应用体外连接法构建了人TrkC重组腺病毒表达载体，Ad-TrkC能在神经干细胞内表达TrkC受体蛋白，这种TrkC受体蛋白具有促进神经干细胞分化为神经元样细胞活性的作用，这为进一步应用NT-3和TrkC联合进行基因治疗中枢神经损伤研究奠定了基础。 第三部分NT-3基因修饰雪旺细胞和nkC基因修饰神经干细胞体外联合培养促进神经干细胞分化为具有形成突触潜能的神经元样细胞 目的：探讨NT-3基因修饰雪旺细胞(SCs)和TrkC基因修饰神经干细胞(NSCs)体外联合培养对神经干细胞分化为具有形成突触潜能的神经元样细胞的影响。 方法：应用各种MOI的Ad-GFP感染SCs和NSCs 24h后流式细胞仪(FCM) 检测SCs和NSCs的感染率，确定最适感染剂量。ELISA法定量检测Ad-NT-3感染SCs 24h后上清中NT-3的含量。X-gal酶组织化学染色检测Ad-LacZ感染的NSCs的β-半乳糖苷酶的表达。将含NT-3基因的重组腺病毒(Ad-NT-3)感染SCs(NT-3-SCs)，同时将含TrkC基因的重组腺病毒(Ad-TrkC)感染NSCs(TrkC-NSCs)，然后两者联合在体外共培养。实验共分6组：NT-3-SCs+TrkC-NSCs组、NT-3-SCs+NSCs组、SCs+NSCs组、NSCs组、LacZ-SCs+LacZ-NSCs组和TrkC-NSCs组。培养4d后做nestin、MAP2、GFAP免疫组化，观察NSCs的分化并计算其中神经元样细胞(MAP2阳性)和星形胶质细胞样细胞(GFAP阳性)的分化率以及保持未分化状态(nestin阳性)的比率，并用PSD95和svnapsin免疫组化方法观察并计算其中具有形成突触潜能的神经元样细胞的比率。 结果：1.SCs的最适感染剂量为10 MOI，NSCs为80 MOI。2.ELISA法显示NT-3-SCs培养液中NT-3的含量明显高于未基因修饰的SCs。3.Ad-LacZ感染的NSCs呈β-半乳糖苷酶阳性。4.NSCs在体外可分化为神经元样细胞和神经胶质样细胞，与其它实验组相比，NT-3-SCs+TrkC-NSCs组能更有效地提高神经元样细胞的分化率，其中具有形成突触潜能的神经元样细胞的比率最高。而LacZ-SCs+LacZ-NSCs组与SCs+NSCs组、NT-3-SCs+NSCs组与TrkC-NSCs组之间没有明显差别。 结论：NT-3基因修饰雪旺细胞和TrkC基因修饰神经干细胞体外联合培养能够促进神经干细胞向具有形成突触潜能的神经元样细胞分化。 第四部分NT-3基因修饰雪旺细胞和TrkC基因修饰神经干细胞联合移植促进全横断脊髓损伤修复的研究 目的：探讨NT-3基因修饰SCs和TrkC基因修饰NSCs联合移植能否促进全横断脊髓损伤修复的研究。 方法：用NT-3基因的重组腺病毒(Ad-NT-3)感染培养的SCs(NT-3-SCs)．同时用含TrkC基因的重组腺病毒(Ad-TrkC)感染培养的NSCs(TrkC-NSCs)。此外，还将Ad-LacZ分别感染SCs和NSCs。然后建立大鼠全横断脊髓损伤模型，将NSCs、LacZ-SCs+LacZ-NSCs、NT-3-SCs+NSCs和NT-3-SCs+TrkC-NSCs分别移植到损伤处。所有动物存活60d后，进行爬网格测验和BBB评分。接着在脊髓横断处远端3mm组织内注射荧光金(FG)，动物再存活7d。在处死动物前检测皮质运动诱发电位(CMEP)和皮质体感诱发电位(CSEP)。最后灌注固定动物，取材和切片并行形态学观察。 结果：1.行为学检测显示，各细胞移植组与对照组相比，能促进大鼠后肢运动功能的恢复，其中恢复最好的是NT-3-SCs+TrkC-NSCs组。2.电生理检测显不NT-3-SCs+TrkC-NSCs组CSEP、CMEP的峰值明显增大。3.NSCs能在损伤脊髓内分化为神经元样细胞和神经胶质样细胞。NT-3-SCs和TrkC-NSCs联合移植能提高NSCs在损伤脊髓内向神经元样细胞的分化率，NT-3-SCs+TrkC-NSCs组的MAP2阳性细胞的比率为24.63％，高于其它处理组。4.各细胞移植组在脊髓横断处及附近有GAP-43、PSD95和synapsin阳性神经元样细胞，以及5-HT、D β H和ChAT阳性神经纤维。5.在移植组中，脊髓横断处头侧端、中脑红核及大脑体感运动区皮质内锥体细胞层有少量FG标记神经元。6.与其它组相比，NT-3-SCs+TrkC-NSCs组L<,1>脊髓背核、中脑红核及大脑体感运动区皮质内锥体细胞层存活的神经元数增多。7.基因修饰细胞移植到受损伤脊髓2个月后仍能表达外源基因产物(NT-3、TrkC和LacZ)。8.NT-3.SCs和TrkC-NSCs联合移植能提高LN的表达，降低CSPGs的表达。9.电镜下可见细胞移植组的脊髓损伤区内有再生的有髓鞘神经纤维和突触样结构。 结论：NT-3基因修饰SCs和TrkC基因修饰NSCs联合移植能够促进大鼠全横断脊髓损伤的修复。