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目的:柯萨奇病毒属于小RNA病毒科肠道病毒属。其中B组3型（Coxsackievirus group B type 3, CVB3）所致的病毒性心肌炎严重危害人类健康,也是儿童和青少年猝死的重要原因,迄今尚无有效的预防手段。VP1是CVB3主要的衣壳蛋白,含有多个T、B细胞表位,可诱导机体产生免疫应答。基因工程亚单位疫苗是将目的基因克隆到原核或真核表达载体中,在原核或真核细胞中表达,经纯化制备的疫苗。亚单位疫苗具有较强的免疫原性,成分单一,可显著提高抗体水平,免除非抗原成分引起的副作用,保证疫苗的安全性。本室前期将VP1基因克隆到原核表达载体,在大肠杆菌成功表达了VP1蛋白,经纯化后免疫小鼠。结果显示VP1蛋白能诱导产生较高水平的体液免疫和细胞免疫应答,但未能达到满意的保护效果。因此,进一步增强VP1蛋白的免疫原性,提高CVB3特异性体液和细胞免疫应答,已成为倍受关注的研究方向。有多种因素影响机体对抗原的免疫应答强度及类型,主要是抗原物质本身的性质和进入机体的途径、剂量、次数、免疫间隔时间以及免疫佐剂的类型等。本研究用原核细胞表达得到纯化CVB3VP1蛋白,选取3种常用免疫途径,3种免疫剂量,联合3种免疫佐剂共同免疫小鼠。观察不同免疫途径,不同剂量和不同佐剂对免疫效果的影响。方法:1将我室构建的原核表达质粒pET-his/VP1转入表达宿主菌BL21（DE3）pLysS,诱导表达携带有6×HIS标签的VP1蛋白,经SDS-PAGE和Western-blot鉴定。2将大量诱导表达后的菌体在冰浴中超声破碎,分离上清和包涵体沉淀,经SDS-PAGE分析,结果表明蛋白以包涵体形式存在,用尿素溶解沉淀,利用金属镍离子亲和层析柱纯化目的蛋白,透析后浓缩蛋白。3动物实验:分二期进行。第一期将小鼠随机分为3组,每组12只,分别为腹腔注射组、皮下注射组、肌肉注射组。纯化后的蛋白以PBS稀释后,经过腹腔、颈背部皮下和股四头肌注射免疫小鼠。初次免疫加完全弗氏佐剂,以后免疫用不完全弗氏佐剂。每次每只接种100μg;每3周免疫1次,共免疫3次;每次免疫后第14天,内眦静脉取血,分离血清,用微量中和试验（固定病毒-稀释血清法）检测血清中CVB3特异性中和抗体的水平;用纯化VP1抗原包被酶联板,采用ELISA方法检测小鼠血清抗体IgG抗体效价。经过比较选择最佳免疫注射途径,进行第二期动物实验。4第二期动物实验:将6～8周龄雄性BALB/c小鼠随机分为6组,每组18只。纯化后的蛋白以PBS稀释后,采用肌肉注射途径免疫,①低剂量组:每次每只接种50μg。②中剂量组:每次每只接种100μg。③高剂量组:每次每只接种150μg。以上3组初次免疫加完全弗氏佐剂,以后免疫用不完全弗氏佐剂。④氢氧化铝佐剂组:每次每只接种100μg。⑤ISA 720组:每次每只接种100μg。⑥PBS组。每3周免疫1次,共免疫3次;每次免疫后第14天,内眦静脉取血,分离血清,用微量中和试验（固定病毒-稀释血清法）检测血清中CVB3特异性中和抗体的水平;用纯化VP1抗原包被酶联板,采用ELISA方法检测小鼠血清特异性抗体效价。第3次免疫后3周,每组3只小鼠取脾脏制备淋巴细胞悬液,采用细胞计数试剂盒（cell counting kit-8, CCK-8）法进行特异性淋巴细胞增殖活性和特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）杀伤活性的检测;另每组12只小鼠用致死量的CVB3(4LD50)进行腹腔注射,观察并记录小鼠死亡情况至感染后第21天;每组剩余的3只小鼠用CVB3(3LD50)攻击,注射病毒后第7天处死,用于血中病毒滴度的测定。结果:1 SDS-PAGE和Western-blot证实原核表达质粒pET-his/VP1转化的大肠杆菌BL21（DE3）pLysS成功表达了CVB3 VP1蛋白,蛋白主要以包涵体形式存在。2不同免疫途径各组各次免疫后血清中和抗体滴度分别为:腹腔注射组: 1:7.08,1:28.18,1:42.66;皮下注射组:1:7.08,1:11.22,1:35.48;肌肉注射组:1: 8.91,1:47.86,1:70.79。血清特异性IgG抗体分别为:皮下注射组:1:155,1: 7600,1:11800;腹腔注射组1:240, 1:8300,1:17000;肌肉注射组1:425,1:22400,1:38400。单因素方差分析表明,三次免疫后,各组中和抗体和特异性IgG抗体滴度逐次增加（P<0.05）。三次免疫后,中和抗体和特异性IgG抗体:肌肉注射组>腹腔注射组>皮下注射组（P<0.01）。3经肌肉注射途径免疫后,不同剂量各组血清中和抗体效价分别为:低剂量组:1:6.31, 1:42.66, 1:47.86;中剂量组:1:7.08, 1:44.67, 1:63.10;高剂量组: 1:7.08, 1:50.12,1:70.79。血清特异性IgG水平:低剂量组: 1:200, 1:6400, 1: 19200;中剂量组: 1:398, 1:21000, 1:36300;高剂量组: 1:425, 1:23040, 1:51200。单因素方差分析表明,三次免疫后,各组中和抗体和特异性IgG抗体滴度逐次增加（P<0.05）。末次免疫后各组比较差别有统计学意义。中和抗体和特异性IgG抗体:高剂量组>中剂量组>低剂量组（P<0.05）。4不同佐剂组各次免疫后血清中和抗体滴度为:氢氧化铝佐剂组: 1:5.62, 1:12.59, 1:26.92;弗氏佐剂（中剂量）组: 1:7.08, 1:44.67, 1:63.10; ISA720佐剂组: 1:8.91, 1: 44.67, 1: 85.11。各次免疫后血清特异性IgG水平:氢氧化铝佐剂组: 1:150, 1:1600,1:11800;弗氏佐剂（中剂量）组:1:398, 1:21000, 1:36300; ISA720佐剂组:1:280, 1:12800,1:38400。单因素方差分析表明,三次免疫后,各组中和抗体和特异性IgG抗体滴度逐次增加（P<0.05）。末次免疫后各组比较差别有统计学意义。中和抗体:ISA720佐剂组>弗氏佐剂组>氢氧化铝佐剂组（P<0.05）。特异性IgG抗体:ISA720组和弗氏佐剂组高于氢氧化铝佐剂组,（P<0.05）弗氏佐剂组和ISA720组差别无统计学意义（P>0.05）。5小鼠脾脏淋巴细胞增殖活性,以CVB3或Con A刺激,各组均高于PBS组（P<0.05）;以CVB3刺激,高剂量组高于低剂量组和中剂量组（P<0.05）; ISA720佐剂组高于弗氏佐剂组和氢氧化铝佐剂组（P<0.05）。ConA刺激时,各组均显著高于PBS组（P<0.05）。各组之间差别无统计学意义。6小鼠脾脏特异性CTL杀伤活性,各组均显著高于PBS组（P<0.05）;高剂量组高于中剂量组和低剂量组（P<0.05）;弗氏佐剂组和ISA720组高于氢氧化铝组（P<0.05）。7用4LD50攻击小鼠,PBS组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、氢氧化铝佐剂组、ISA720佐剂组的21天生存率分别为: 0、66.67%、66.67%、50%、33.33%和50 %。经χ2检验分析,各组之间无明显差异（P>0.05）。经Kaplan-Meier法进行生存分析表明,各组生存率曲线分布有差别（P<0.05）。低剂量组和中剂量组的生存时间好于高剂量组,弗氏佐剂组生存时间好于氢氧化铝佐剂组（P<0.05）。8各组血清病毒滴度均比PBS组低（P<0.05）。单因素方差分析显示,高剂量组血中病毒滴度低于低、中剂量组（P<0.05）;ISA720佐剂组低于氢氧化铝组（P<0.05）。结论:1成功在原核细胞表达了CVB3 VP1蛋白,并进行了纯化。2三种免疫途径接种,各组血清中和抗体和IgG抗体滴度均随免疫次数的增加而提高,肌肉免疫能诱导更高的体液免疫水平。3采用肌肉注射途径免疫,中和抗体和IgG抗体水平随免疫剂量增加而提高。用致死量病毒攻击后,病毒载量随免疫剂量增加而降低,但低剂量组的生存时间好于其他剂量组。4三种佐剂比较,弗氏佐剂和ISA 720佐剂的对VP1蛋白的免疫增强作用优于氢氧化铝佐剂。但是弗氏佐剂不能应用于人,因此ISA 720佐剂是一种值得进一步研究的有效佐剂。5采用合适剂量（50-100μg /只）的VP1蛋白,应用弗氏佐剂或ISA 720佐剂,选择肌肉注射途径免疫可获得较好的免疫效果。