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第一部分:促心肌肥厚转录因子GATA4内源性抑制因子的筛选与鉴定目的:利用互作蛋白质谱技术筛选GATA4蛋白内源性抑制因子的候选分子,初步探究候选分子对GATA4蛋白活性的影响。方法:利用50μM去氧肾上腺素（phenylephrine,PE）刺激大鼠心脏成肌细胞系H9C2细胞,以磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution,PBS）为对照,建立离体病理性心肌细胞肥大模型,通过互作蛋白质谱发掘GATA4互作蛋白中内源性抑制因子的候选分子。构建GATA4内源性抑制因子候选分子的表达质粒,通过双荧光素酶报告基因检测实验筛选出能有效抑制GATA4蛋白活性的内源性抑制因子分化型胚胎软骨发育基因1（differentiated embryo chondrocyte 1,DEC1）。构建DEC1和GATA4的不同结构域截短的表达质粒,将这些质粒转染人胚肾293T细胞,通过蛋白免疫共沉淀（co-immunoprecipitation,co-IP）实验进一步明确DEC1与GATA4蛋白的结合与互作结构域。结果:互作蛋白质谱结果筛选到两次独立重复实验中PBS组含有而PE组不含有的3个GATA4内源性抑制因子候选分子,分别为HNRNPU,DEC1,RSL1D1L1。双荧光素酶报告基因检测结果提示,DEC1能明显抑制GATA4蛋白活性,且抑制作用呈剂量依赖的方式,而HNRNPU与RSL1D1L1对GATA4蛋白活性无明显影响。co-IP实验结果发现,DEC1与GATA4蛋白具有良好的结合,DEC1蛋白b HLH结构域与GATA4蛋白C端锌指（ZNII）结构域分别是介导两者结合的区段。结论:DEC1能明显抑制GATA4蛋白活性,DEC1蛋白bHLH结构域与GATA4蛋白ZNII结构域能介导两者结合。第二部分:DEC1对病理性心肌细胞肥大与心肌肥厚的影响目的:建立离体病理性心肌细胞肥大细胞模型和在体病理性心肌肥厚动物模型,探究GATA4内源性抑制因子DEC1在病理性心肌细胞肥大与心肌肥厚中的作用。方法:构建过表达（AdDec1）和敲低（Adsh Dec1）Dec1的腺病毒,利用腺病毒感染新生大鼠原代心肌细胞（neonatal rat ventricular myocytes,NRVM）和H9C2细胞,对照组分别感染相同滴度的对DEC1表达无影响的对照腺病毒AdGfp和Adsh Scr,使用PE刺激H9C2和NRVM细胞,建立病理性心肌肥厚的离体细胞模型,通过蛋白免疫印迹实验（Western Blotting）,荧光定量PCR实验（Real-Time PCR）和细胞免疫荧光实验评价Dec1功能增强和功能减弱对心肌细胞肥大的影响。利用全身性Dec1基因敲除（Dec1-KO）小鼠进行主动脉弓缩窄术（transverse aortic constriction,TAC）,诱导小鼠发生病理性心肌肥厚,以同窝出生野生型（wild type,WT）小鼠为对照,假手术组（Sham）只在主动脉弓缠绕丝线不结扎,术后4周获取小鼠心脏组织,测量小鼠心重与体重比（heart weight/body weight,HW/BW）,心重与胫骨长比（heart weight/tibial length,HW/TL）,并进行苏木素-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色与麦胚凝集素（wheat germ agglutinin,WGA）染色观察小鼠心肌肥厚与心肌细胞肥大情况;通过Western Blotting检测各组小鼠心脏组织中心肌肥厚标志分子ANP,MYH7及GATA4蛋白表达情况。利用构建好的敲低Gata4的腺病毒（Adsh Gata4）和Adsh Dec1诱导NRVM细胞Dec1和（或）Gata4的功能减弱,检测经PE刺激后的NRVM细胞中Gata4敲低能否逆转Dec1敲低对心肌细胞肥大的影响。结果:离体细胞实验结果提示,利用PE刺激过表达和敲低Dec1的NRVM与H9C2细胞,过表达Dec1后ANP和GATA4蛋白水平明显降低,敲低Dec1后ANP和GATA4蛋白表达显著增加。NRVM和H9C2细胞过表达Dec1能显著下调心肌肥厚标志分子Nppa和Nppb m RNA的表达,而敲低Dec1后Nppa和Nppb m RNA的表达明显上调。细胞免疫荧光实验结果提示,过表达Dec1能抑制经PE刺激的NRVM细胞肥大,而敲低Dec1可促进NRVM病理性肥大。Dec1基因敲除能显著加重主动脉弓缩窄术（TAC）诱导的病理性心肌肥厚,并能明显促进ANP,MYH7与GATA4蛋白在TAC术后进一步上调。敲低Gata4能明显抑制Dec1沉默后对PE诱导的NRVM细胞肥大的影响,同时也能抑制NRVM细胞Dec1敲低后对Nppa和Nppb表达的促进作用。结论:DEC1能明显抑制病理性心肌细胞肥大和心肌肥厚,DEC1对病理性心肌细胞肥大的抑制作用是通过对GATA4蛋白活性抑制而实现的。第三部分:DEC1抑制GATA4蛋白活性机制的探索目的:检测GATA4蛋白及其第105位丝氨酸磷酸化(p-GATA4Ser105)水平,GATA4蛋白核质分布情况,利用体内和体外泛素化实验检测DEC1对GATA4蛋白泛素化修饰水平和修饰类型的影响,探究DEC1抑制GATA4蛋白活性的机制。方法:利用AdGfp和AdDec1感染H9C2和NRVM细胞,建立PE刺激诱导的NRVM和H9C2细胞肥大模型,通过Real-Time PCR实验检测DEC1是否影响Gata4m RNA的表达。利用过表达Dec1的H9C2和NRVM细胞体外建立PE诱导的病理性心肌细胞肥大模型,通过Western Blotting实验检测Dec1过表达对p-GATA4Ser105水平和GATA4总蛋白的影响。利用经PE刺激的感染AdGfp和AdDec1的H9C2细胞进行核质分离实验,通过Western Blotting实验检测过表达Dec1是否影响GATA4蛋白的核质分布。利用50μM蛋白酶体抑制剂MG132,10μM溶酶体抑制剂氯喹（chloroquine,CQ）,以及等量的PBS分别处理感染AdGfp和AdDec1的H9C2和NRVM细胞,检测PE刺激24h后,MG132和CQ对DEC1促进GATA4蛋白降解作用的影响。利用GATA4,DEC1和不同类型的泛素分子表达质粒转染293T细胞,通过co-IP实验和Western Blotting实验检测DEC1对GATA4蛋白泛素化修饰作用的影响和影响GATA4蛋白发生哪些类型的泛素化修饰。利用GATA4表达质粒,Myc-Ub-K6O和Myc-Ub-K63O表达质粒分别转染293T细胞,并利用50μM MG132处理相应时间（6h和12h）,通过co-IP实验和Western Blotting实验检测MG132处理对GATA4蛋白K6和K63类型泛素化修饰水平和GATA4蛋白表达水平的影响。利用体外条件转录和翻译得到的GATA4,DEC1和已知能直接促进GATA4蛋白泛素化修饰的E3连接酶PARKIN蛋白,以及泛素分子Myc-Ub,在离体反应体系中进行泛素化实验,分别检测DEC1和PARKIN对GATA4蛋白泛素化修饰作用的影响,探究DEC1是否具有E3连接酶功能。结果:Real-Time PCR结果表明,过表达和敲低Dec1均不影响经PE刺激的NRVM和H9C2细胞中Gata4 m RNA的表达。Western Blotting结果显示,NRVM和H9C2细胞过表达Dec1不但能抑制PE刺激后p-GATA4Ser105蛋白水平,也能抑制GATA4总蛋白的上调。H9C2细胞核质分离实验结果发现,DEC1能抑制细胞核和细胞质中PE刺激后GATA4的上调,但不改变GATA4蛋白的相对核质分布。GATA4蛋白降解途径探索实验提示,蛋白酶体抑制剂MG132能显著抑制DEC1对GATA4蛋白降解的促进作用,而溶酶体抑制剂CQ处理后,DEC1对GATA4蛋白降解的促进作用无明显变化。GATA4蛋白泛素化实验结果显示,DEC1能明显增强GATA4蛋白的泛素化,增强的GATA4泛素化类型为K6和K63类型的泛素化。K6类型的泛素化修饰能介导GATA4蛋白发生泛素-蛋白酶体途径的降解,而K63类型的泛素化修饰对GATA4的降解无明显影响。体外泛素化实验结果提示,DEC1并不是直接促进GATA4发生泛素化的E3连接酶。结论:DEC1通过促进GATA4蛋白发生K6类型的泛素化修饰,进而促进GATA4蛋白泛素-蛋白酶体途径的降解。DEC1不具有E3连接酶活性。第四部分:DEC1促进GATA4蛋白降解过程中E3连接酶的探索目的:利用互作蛋白质谱筛选DEC1促进GATA4蛋白降解过程中E3连接酶的候选分子,探究这些E3连接酶候选分子对GATA4蛋白水平和泛素化修饰水平以及病理性心肌细胞肥大的影响。方法:构建过表达Gata4的腺病毒（AdGata4）,分别利用AdDec1和AdGata4感染H9C2细胞,在PBS处理24h后,收取H9C2细胞进行co-IP实验,分别利用DEC1和GATA4抗体富集与DEC1和GATA4蛋白结合的互作蛋白,将富集好的DEC1和GATA4互作蛋白进行质谱检测。筛选出与DEC1和GATA4蛋白都有结合的E3连接酶作为候选分子。构建E3连接酶候选分子的表达质粒,将这些表达质粒分别与DEC1和GATA4表达质粒转染293T细胞,通过co-IP实验对这些E3连接酶候选分子与DEC1和GATA4蛋白的结合进行验证。分别将E3连接酶候选分子表达质粒,GATA4表达质粒和泛素分子表达质粒转染293T细胞,将DEC1表达质粒作为阳性对照,通过co-IP实验检测E3连接酶候选分子中的哪种E3连接酶参与促进GATA4蛋白的泛素化修饰作用。通过体外泛素化实验检测上述中能促进GATA4蛋白泛素化修饰的E3连接酶PRP19是否是直接促进GATA4的泛素化修饰的E3连接酶。构建过表达Prp19的腺病毒（AdPrp19）,利用AdPrp19感染H9C2细胞和NRVM细胞,利用PE刺激H9C2和NRVM细胞,并给予MG132处理,通过Western Blotting实验检测H9C2细胞和NRVM细胞中GATA4蛋白表达水平。利用AdGata4和AdPrp19感染H9C2和NRVM细胞,利用PE刺激相应时间,检测PRP19是否影响Gata4过表达后对病理性心肌细胞肥大的影响。结果:利用DEC1抗体和GATA4抗体分别富集与DEC1和GATA4蛋白结合的E3连接酶,将富集下来的蛋白复合体进行互作蛋白质谱分析,通过两组质谱数据联合分析筛选出10个高度可信的E3连接酶（BUB3,CORO1C,CORO2B,EML4,FUS,GNB2,PRP19,SEC31A,TAF3,UPF1）。co-IP实验证实,筛选出的10个E3连接酶与DEC1和GATA4蛋白都有较强结合。体内与体外泛素化实验结果表明,PRP19是促进GATA4发生泛素化修饰的直接的E3连接酶。细胞实验表明,PRP19能促进H9C2及NRVM细胞在病理性肥大过程中GATA4发生泛素-蛋白酶体途径的降解。NRVM细胞逆转实验结果发现,过表达Prp19不但能抑制Gata4功能增强后加重的NRVM细胞病理性肥大,也能抑制经PE刺激的NRVM与H9C2细胞在Gata4过表达后心肌肥厚标志分子Nppa与Nppb的表达上调。结论:E3连接酶PRP19能促进GATA4蛋白泛素化和泛素-蛋白酶体途径的降解,PRP19能抑制Gata4功能增强后加重的病理性心肌细胞肥大。第五部分:DEC1-PRP19介导的GATA4泛素化修饰赖氨酸位点的鉴定目的:查阅GATA4蛋白氨基酸序列,通过泛素化实验对DEC1-PRP19介导GATA4蛋白泛素化修饰赖氨酸位点进行初步鉴定。方法:查阅GATA4蛋白研究的文献,利用蛋白质数据库Uniprot查询GATA4蛋白氨基酸序列,观察GATA4蛋白具有哪些赖氨酸位点。构建GATA4不同单个赖氨酸位点完整型的表达质粒,只保留所有赖氨酸位点中的一个,其余赖氨酸位点全部突变成不具有泛素化修饰作用的甘氨酸位点,将这些表达质粒分别与DEC1,PRP19,泛素分子表达质粒转染293T细胞,通过co-IP实验和Western Blotting实验检测DEC1和PRP19促进GATA4泛素化修饰的赖氨酸位点。将上述中筛选得到的特定赖氨酸位点完整型的GATA4表达质粒与泛素分子表达质粒Myc-Ub转染293T细胞,利用50μM MG132处理相应时间（6h和12h）,通过co-IP实验和Western Blotting实验检测MG132处理后特定赖氨酸位点完整型的GATA4泛素化修饰水平和GATA4蛋白表达水平。结果:通过构建GATA4蛋白不同单个赖氨酸位点完整型质粒,利用GATA4泛素化实验筛选出DEC1和PRP19促进GATA4蛋白泛素化修饰的赖氨酸位点为GATA4蛋白第256号赖氨酸位点。GATA4蛋白第256号赖氨酸位点的泛素化修饰能介导GATA4蛋白发生泛素-蛋白酶体途径的降解。结论:DEC1-PRP19通过促进GATA4蛋白第256号赖氨酸位点泛素化,进而介导GATA4蛋白发生泛素-蛋白酶体途径的降解。