镰孢红素酮（Fusarochromanone,FC101）,是由镰刀菌属木贼镰刀菌（Fusariumequiseti）产生的一种真菌毒素,广泛存在于动物饲料、粮食及农作物中。畜禽持续摄入被FC101污染的食物及饲料后,可能会出现急性症状,也可能导致严重的慢性病变,最终引发癌症,从而给畜禽业造成重大的经济损失。尽管有一些研究对FC101危害人类及动物健康的毒性机制进行探索,但是FC101毒素的毒性机理尚未明确。本研究发现FC101可能通过阻滞细胞于G1期,抑制细胞增殖,引起肾脏细胞COS7,HEK293的毒性作用,并且可能通过caspase依赖和非依赖两种方式引起肾脏细胞死亡。通过进一步探讨FC101引起细胞死亡的分子机制,我们发现FC101可诱导ROS产生,ROS发挥促进凋亡和自噬的作用。此外FC101诱导氧化应激产生细胞毒性可能涉及到了ROS介导的FC101下调PP2A,PP5蛋白表达水平,从而导致JNK通路激活。辅酶Q₁₀(CoQ₁₀)是呼吸链的重要成员之一,它与线粒体内膜相结合,参与细胞氧化磷酸化及ATP生成过程,是细胞自身的天然抗氧化剂,细胞代谢的激活剂。目前临床上CoQ₁₀主要应用于急、慢性充血性心力衰竭,病毒性肝炎和癌症的辅助治疗。CoQ₁₀在ROS造成的损伤下可保护并增强细胞功能。但是关于CoQ₁₀在FC101诱导肾脏细胞死亡中的作用尚未见报道。本实验将探究FC101对肾脏细胞的毒性机制及CoQ₁₀对其的保护效应。试验分为以下四个部分:1.FC101对肾脏细胞周期分布的影响及其机制探讨FC101对肾脏细胞COS7,HEK293的毒性效应。以COS7,HEK293细胞为细胞糢型,FC101（0～5μM）单独处理细胞6天或者24～72h,在倒置相差显微镜下分析细胞形态,one-solution实验测定细胞存活率,流式细胞术检测细胞周期,Western Blot实验分析细胞周期蛋白变化。我们发现,细胞经不同浓度的FC101（0～5μM）处理6天后,细胞细胞密度及个数明显减少,细胞增殖减慢,细胞形态学发生改变,表现为贴壁细胞变圆、皱缩、脱落、细胞体积变小。FC101以浓度依赖方式抑制肾脏细胞COS7,HEK 293增殖,诱导细胞死亡。此外,当细胞暴露于FC101时间为24～72小时后,one-solution检测法结果显示FC101降低细胞活性。流式细胞术检测显示,细胞经FC101处理24小时后,细胞停滞在G₀/G₁期的比例从33.2%上升到57.4%,FC101呈剂量依赖性阻滞细胞周期于G₀/G₁期。此外,用1μM浓度的FC101分别处理细胞24小时,48小时,72小时后,FC101呈时间依赖性阻滞细胞于G₀/G₁期。同时,FC101呈剂量依赖性和时间依赖性下调细胞周期相关蛋白CyclinD1,细胞周期依赖性激酶（CDK4和CDK6）,细胞周期调控因子Cdc25A的表达,同时上调细胞周期素依赖性激酶抑制因子(p21^Cip1,p27^Kip1)的表达,进而导致Rb去磷酸化。结果表明,FC101通过下调细胞周期调控因子Cyclin D1、CDK4、CDK6、Cdc25A、p-Rb,上调细胞周期素依赖性激酶抑制因子p21^Cip1,p27^Kip1的表达进而阻滞细胞于G₀/G₁期,从而抑制细胞增殖,引起细胞毒性作用。2.FC101对肾脏细胞凋亡和自噬的影响探究FC101如何诱导细胞死亡以及FC101诱导细胞死亡的分子机制。以COS7,HEK293细胞为细胞模型,FC101（0～5μM）单独处理细胞或者使用泛caspase抑制剂（Z-VAD-FMK）、自噬抑制剂（CQ）、ROS清除剂（NAC）预处理细胞后联用FC101（0～5μM）处理0～72小时;采用腺病毒Ad-GFP-LC3感染COS7细胞24小时后,再用FC101处理24小时。Trypan blue拒染法检测细胞死亡率、Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术和DAPI染色检测细胞凋亡、免疫荧光染色法检测自噬、CM-H2DCFDA检测细胞内活性氧（ROS）的生成、Caspase-3/7 Assay试剂盒检测Caspase-3/7活性,Western Blot分析BAD、BAX、BAK、Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1、survivin、DR5、cleaved caspase 3、cleaved caspase 8、cleaved PARP、AIF、LC3A/B、H2A、γ-H2AX（ser139）、p53、ATM、phospho-ATM（ser1981）、ATR、phospho-ATR（ser428）、NFκB（p65）,phospho-NFκB（p65）（Ser139）蛋白表达及活性表现。我们发现,FC101呈剂量依赖和时间依赖方式引起细胞死亡。同时FC101呈浓度依赖方式上调促凋亡蛋白BAD及外部死亡受体通路蛋白DR5的表达,下调抗凋亡蛋白Mcl-1、Bcl-2、Bcl-xL、survivin表达,提高cleaved caspase8蛋白表达量及活化caspase3,并以浓度依赖方式造成PARP裂解。但是并未显著引起促凋亡基因BAK和BAX的表达变化。此外,细胞经FC101处理后,激光共聚焦荧光显微镜观察下发现,细胞核经DAPI染色后出现核皱缩,核碎裂,染色质聚集等凋亡特征,我们还发现FC101诱导凋亡诱导因子AIF发生核移位,AIF由胞质转移至细胞核。并且FC101诱导细胞发生自噬,表现为自噬相关蛋白LC3Ⅱ颗粒聚集程度增加,LC3Ⅱ蛋白表达量提高,使用自噬抑制剂氯喹（CQ）处理细胞后,通过one-solution实验分析可知自噬抑制剂CQ显著提高细胞存活率,减轻FC101对细胞的毒性作用。另外,使用特异性荧光探针CM-H2DCFDA检测细胞内ROS的生成发现FC101引起细胞内ROS水平呈浓度依赖性和时间依赖性升高。激光共聚焦荧光观测结果显示ROS清除剂NAC可使细胞核碎裂减少,保持胞核完整性,减少凋亡细胞数量。NAC显著降低胞质内LC3Ⅱ颗粒聚集程度。同样NAC降低促凋亡蛋白BAD,cleavedcaspase3的蛋白表达量,增加抗凋亡蛋白Bcl-xL的表达量。此外,FC101以浓度依赖方式激活NFκB、P53,并且引起DNA损伤蛋白H2AX和ATM磷酸化表达水平升高。结果表明,FC101诱导COS7、HEK293细胞发生凋亡及自噬,引起细胞死亡,机制上可能涉及NFκB和p53信号转导。并且FC101诱导ROS产生,ROS发挥促进凋亡和自噬的作用。此外FC101可能造成DNA损伤。3.氧化应激和JNK信号通路介导的FC101诱导肾脏细胞毒性机制研究探讨FC101致肾脏细胞COS7,HEK293死亡的毒性机制及涉及到的相关信号通路。COS7和HEK293细胞为细胞模型,FC101（0～5μM）单独处理或使用ROS清除剂（NAC）,JNK抑制剂SP600125预处理细胞1小时后联用FC101（0～5μM）处理24小时;采用腺病毒干扰,过表达c-Jun、PP2A、PP5后,经FC101（0.5,1μM）处理24小时。CM-H2DCFDA检测细胞内活性氧（ROS）生成,倒置相差显微镜下分析细胞形态,one-solution实验测定细胞存活率,Western Blot分析MAPK信号通路中MAPK（Erk1/2、JNK、p38）和蛋白磷酸酶（PP2A,PP5）的表达水平。我们发现,FC101诱导ROS产生,激活JNK信号通路,使用JNK抑制剂（SP600125）或者使用腺病毒过表达c-Jun后可削弱FC101对细胞的毒性。N-乙酰-L半胱氛酸（NAC）预处理后可明显清除FC101诱导下的ROS产生。此外,ROS抑制JNK通路激活,减轻细胞毒性。FC101引起ROS水平升高,降低丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A（PP2A）和丝氛酸/苏氨酸蛋白磷酸酶5（PP5）的表达量,NAC则阻止FC101下调蛋白磷酸酶PP2A,PP5的表达量。此外,过表达PP2A,PP5可抑制JNK磷酸化以及减轻细胞毒性。结果表明,FC101通过诱导ROS,下调蛋白磷酸酶PP2A,PP5的表达,进而激活JNK通路引起肾脏细胞毒性作用。4.CoQ₁₀通过抑制氧化应激及JNK通路保护FC101诱导COS7细胞毒性探讨COQ₁₀对于FC101损伤细胞后的保护作用及其保护机制。本实验以COS7细胞作为细胞模型,使用FC101（0～5μM）单独处理或者使用CoQ₁₀,或JNK抑制剂SP600125预处理细胞1小时或30分钟后,联用FC101（0～5μM）处理6天或24小时;采用腺病毒干扰,过表达c-Jun后,细胞经CoQ₁₀预处理1小时,再用FC101（1μM）处理24小时。CM-H2DCFDA检测细胞内活性氧（ROS）的生成,倒置相差显微镜下分析细胞形态,one-solution实验测定细胞活性,Western Blot分析c-Jun、Bad、Bcl-xL和cleaved-caspase3的表达水平。我们发现,FC101通过诱导ROS引起细胞凋亡,CoQ₁₀可通过阻止ROS产生,进而抑制细胞凋亡。CoQ₁₀可显著削弱FC101诱导下的细胞活性降低,并且CoQ₁₀恢复细胞形态学,抑制细胞核皱缩及碎裂。CoQ₁₀可减少Bad的表达水平、提高Bcl-xL的的表达水平、降低caspase-3的活性。此外,CoQ₁₀抑制JNK通路激活。使用JNK抑制剂（SP600125）或腺病毒过表达c-Jun则增强CoQ₁₀削弱FC101诱导下的细胞毒性。结果表明,FC101诱导氧化应激产生细胞毒性,COQ₁₀通过抑制ROS及JNK通路从而保护FC101诱导下的细胞损伤。