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Nrf2-ARE(转录因子NF-E2相关因子2)是抗氧化防御体系的第一道防线,是细胞对抗病毒感染所引起氧化应激最重要的防御系统。Nrf2抗氧化通路不仅是天然免疫和病毒调控研究领域的热点,也是氧化应激相关疾病(病毒性疾病、癌症、心血管系统疾病和炎症等疾病)预防和治疗的靶点。马传染性贫血病毒(EIAV)与人免疫缺陷病毒(HIV-1)、猴免疫缺陷病毒(SIV)等均隶属于逆转录病毒科慢病毒属。该属病毒感染临床上皆以反复发热、持续感染、炎性反应强烈且难产生有效免疫保护为共同特征。因此,宿主如何克服病毒的持续性感染、调控炎症平衡、产生有效的免疫控制仍是该领域亟待解决的科学问题。EIAV在慢病毒研究领域的重要意义正在于此。90%EIAV感染马会转归为无症状的携带状态,说明宿主获得了对病毒复制的免疫控制。这一独特性使EIAV成为研究如何实现天然免疫控制慢病毒感染的重要模型。我们通过对EIAV感染后的转录组数据分析发现,重要的天然免疫通路—Nrf2抗氧化通路的相关基因上调明显。因此,本研究从抗氧化应激与病毒感染这一角度,探讨了Nrf2-ARE抗氧化通路对EIAV感染调控的分子机制。为了保障实验的开展,本研究首先利用经典的单克隆技术制备并获得了马源的Nrf2单克隆抗体,获得的单克隆抗体可有效识别过表达及内源性Nrf2的表达,具有较高的敏感性和特异性,可用于后续机制的研究。在此基础上,利用Nrf2-ARE-luc报告系统,结合Nrf2的磷酸化水平及细胞质和细胞核内的分布情况等方面的综合检测,筛选并确认了EIAV Rev可以有效激活Nrf2-ARE抗氧化通路。Co-IP结果显示,Rev可以和Nrf2的负调控因子Keap1结合,且Rev和Keap1结合的结构域与Nrf2和Keap1结合的结构域非常相似。该结果提示,三个蛋白间可能存在竞争性结合。为此,分别构建了3个蛋白的表达载体,经表达、纯化及生物素标记后,进行了Rev-Keap1和Nrf2-Keap1亲和力检测及竞争性试验。结果显示,Rev-Keap1与Nrf2-Keap1这3个蛋白间存在竞争性结合关系。并且,这种竞争性结合促进了Nrf2的入核。另外发现,干扰Nrf2的内源性表达后,EIAV的复制水平上调,而过表达Nrf2可以显著抑制EIAV的复制。说明Nrf2激活后可以抑制EIAV复制。综上所述,本研究成功制备了马源Nrf2单克隆抗体,明确了EIAV Rev通过与Keap1的结合竞争性抑制了Keap1-Nrf2的结合,使Keap1对Nrf2的绑定能力减弱,导致Nrf2进入细胞核,与其下游作用原件ARE结合。从而激活Nrf2这一重要的抗氧化通路的分子机制。本研究所获的结果,不仅明确了EIAV激活Nrf2抗氧化通路的分子细节,也为进一步探讨宿主对EIAV的天然免疫调控奠定了重要基础。