环形多肽表面修饰PET人工韧带促进骨整合的实验研究

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目的:应用cyclo-RGDFV环形多肽表面修饰的PET人工韧带与骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)共培养,探索 cyclo-RGDFV多肽表面修饰PET人工韧带后其生物相容性情况;并用cyclo-RGDFV环形多肽表面修饰的PET人工韧带重建兔前交叉韧带(anterior cruciate ligament,ACL),研究cyclo-RGDFV多肽表面修饰PET人工韧带与骨界面的骨整合情况。方法:应用NaOH碱性水解法处理PET人工韧带,将处理的PET人工韧带与不同浓度的cyclo-RGDFV多肽进行结合,利用X线衍射分析(XPS)技术,分析韧带与多肽共价结合情况;用骨髓间充质干细胞与cyclo-RGDFV环形多肽表面修饰的PET人工韧带共培养,以与未处理的PET人工韧带共培养做对照,观察细胞粘附、增殖及分化情况。成年雄性新西兰大白兔64只,随机分成2组,实验组植入环形多肽表面修饰的PET人工韧带重建前交叉韧带(共32膝),对照组植入未处理的PET人工韧带(共32膝),分别于术后4、8、12、24周取材做大体观察、组织学和生物力学检测;另取6只兔的正常膝关节,行生物力学测定,作为空白组。结果:(1)XPS分析技术证实NaOH碱性水解法处理的PET人工韧带经过cyclo-RGDFV环形多肽表面修饰后,PET人工韧带氮元素含量明显增高,1.Omg/ml cyclo-RGDFV多肽表面修饰的PET人工韧带氮元素含量最高;(2)cyclo-RGDFV环形多肽表面修饰的PET人工韧带与未处理的PET人工韧带比较细胞早期粘附、增殖情况更好,12h、24h、48h粘附细胞数与未处理的PET人工韧带比较均有统计学差异(P<0.01);且骨髓间充质干细胞与环形多肽表面修饰的PET人工韧带共培养14d、21d后表达显著高的ALP活性,与未处理的PET人工韧带共培养细胞比较有统计学差异(P<0.05)。(3)组织学观察:实验组术后4周,韧带-骨界面纤维结缔组织连接相对紧密,部分区域可见类软骨细胞,排列不规则;术后8周,韧带-骨界面部分标本可见胶原纤维直接插入骨隧道形成有序的Sharpey纤维结构,类软骨细胞逐渐成熟,排列也规则,软骨移行带慢慢形成;术后12周,韧带-骨界面区可见明显纤维结缔组织、纤维软骨带,部分区域可见钙化纤维软骨;术后24周,韧带-骨界面区可见纤维软骨带、钙化纤维软骨带,类似正常韧带直接止点结构。而对照组术后4周,韧带-骨界面可见疏松结缔组织,含成纤维细胞、新生的毛细血管,可见到炎细胞浸润表现;术后8周,韧带-骨界面之间纤维组织更加致密,韧带被包裹紧密,可见成骨反应,部分区域可见类Sharpey纤维样结构;术后12周,韧带-骨界面可见Sharpey纤维结构,部分区域可见类软骨细胞、新骨形成,未见钙化纤维软骨;术后24周,韧带-骨界面可见纤维软骨带样结构,紧密连接的纤维组织中软骨细胞明显成熟,未见钙化纤维软骨。(4)生物力学结果发现,在不同时间点都将人工韧带从骨隧道中拉出,韧带均未见断裂。结果显示实验组术后12周、24周最大抗拉强度明显高于对照组,两组比较差异均有显著统计学意义(P<0.01),实验组术后4周、8周最大抗拉强度与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);实验组、对照组术后12周与24周最大抗拉强度比较差异无统计学意义(P>0.05),实验组、对照组术后4、8、12周最大抗拉强度比较差异均有显著统计学意义(P<0.05);空白组与实验组、对照组术后4、8、12、24周最大抗拉强度比较差异均有显著统计学意义(P<0.01)。结论:cyclo-RGDFV环形多肽表面修饰PET人工韧带对骨髓间充质干细胞粘附、增殖和分化均有促进作用,能显著提高PET人工韧带的生物相容性;cyclo-RGDFV环形多肽表面修饰PET人工韧带重建ACL后,其骨隧道中人工韧带-骨界面可通过纤维软骨、钙化软骨结构形成直接连接,有效改善骨隧道中人工韧带-骨界面的骨整合情况,形成人工韧带-骨界面的直接愈合。
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