论文部分内容阅读
水杨酸（Salicylic acid,SA）是重要的植物激素,与抗病防御密切相关。异分支酸合成酶（Isochorismate synthase,ICS）是植物水杨酸合成途径的重要基因,包括ICS1和ICS2。其中ICS1起到主要的作用,负责将分支酸转化为异分支酸。ICS1基因在猕猴桃中的功能还未报道过,也没有验证过。通过对猕猴桃转录组数据的分析,在猕猴桃溃疡病侵染的叶片中,ICS1基因上调表达,在研究前期通过液相色谱质谱联用技术（LC-MS）测定了‘红阳’（感病）与‘金魁’（抗病）的叶片中水杨酸的含量;并通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测了不同猕猴桃AcICS1基因的表达模式,发现两者存在表达差异,而水杨酸与植物抗病性息息相关。后期利用猕猴桃全基因组序列,对猕猴桃AcICS1基因进行了克隆和分析,通过载体构建及瞬时表达、原位杂交和转基因等方法来验证AcICS1基因的功能。主要研究结果如下:1猕猴桃叶片水杨酸的测定:‘红阳’和‘金魁’接种Psa菌液1 d后,猕猴桃叶片中SA的含量都有明显增加,其中红阳增加了 0.5倍,金魁增加了 0.8倍。金魁的SA的含量变化更明显。2猕猴桃AcICS1基因的表达:利用RT-qPCR,分别对实生美味组培材料和盆栽猕猴桃进行AcICS1基因的RT-qPCR分析,猕猴桃溃疡病菌液处理3小时后AcICS1基因在实生美味组培中显著上调表达。在3-6 h期间呈显著上升趋势,在6-48 h逐渐趋于稳定,达到最大值。未侵染的‘红阳’和‘金魁’的叶片AcICS1基因表达没有显著差异,侵染的叶片则有显著性差异,‘红阳’AcICS1基因下调表达,‘金魁’AcICS1基因上调表达。3AcICS1基因在猕猴桃组织间的表达:运用原位杂交（FISH）的方法,对‘红阳’猕猴桃不同组织间AcICS1基因的表达进行了检测。发现在根、茎、叶中都存在AcICS1的表达。注射过猕猴桃溃疡病菌液的猕猴桃的根、茎、叶的AcICS1基因的表达量要高于未接种的。说明猕猴桃溃疡病菌能诱导AcICS1基因的上调表达。4猕猴桃AcICS1基因的克隆与生物学分析:分别克隆了‘红阳’与‘金魁’的AcICS1基因的cDNA全长序列和启动子序列,编码区基因全长1710 bp,编码569个氨基酸,对氨基酸序列进行了简单的理化性质分析。AcICS1基因具有Chorismatebind结构域,包含氨基酸256个（287-543）。分别构建了超表达载体、P1300重组载体。启动子序列上都有典型的真核基因启动子的核心元件TATA box和CAAT box,与光调控、逆境胁迫、植物激素相关的多种顺式元件。其中‘金魁’AcICS1基因的启动子上有响应水杨酸的元件TCA-element。5瞬时表达烟草叶片水杨酸的测定:LC-MS结果表明注射过AcICS1基因P1300重组载体菌液的本氏烟草叶片,SA含量比注射过P1300空载菌液叶片的增加了 1倍。与之相反,茉莉酸（JA）的含量减少了 0.25倍。过量表达AcICS1基因导致SA的上调表达,JA的下调表达。6植物遗传转化:建立了猕猴桃稳定的再生体系,对筛选培养基上的植株提取DNA进行PCR检测,得到‘金魁’AcICS1基因超表达的阳性植株3株。综上可知,在猕猴桃抗病中SA十分重要,AcICS1作为SA合成途径的关键基因,在抗溃疡病的研究中,起到重要的作用。为进一步分析猕猴桃AcICS1基因在水杨酸合成及抗病调控中的作用奠定了基础。