论文部分内容阅读
目的:验证lncRNA KCNQ1OT1在结肠癌细胞外泌体中的表达。明确lncRNA KCNQ1OT1在结肠癌细胞HCT-116和HT-29中的功能,并探讨其在结肠癌细胞中发挥作用的分子机制。方法:使用超速离心法分离提纯外泌体,使用高分辨率投射电子显微镜对外泌体进行鉴定;通过Western Blot验证外泌体标志物蛋白;分别提取外泌体和结肠癌细胞中的RNA进行逆转录、PCR扩增,PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,验证lncRNA KCNQ1OT1在外泌体的表达;在结肠癌HCT-116和HT-29细胞系中转染KCNQ1OT1的过表达质粒及空白对照,siRNA干扰KCNQ1OT1及空白对照;分别各个组内完成CCK8增殖实验、划痕愈合实验、Transwell迁移实验、细胞侵袭实验以验证KCNQ1OT1对细胞功能的影响;免疫共沉淀(RNA immune Precipitation,RIP)和双荧光素酶标记实验分别验证KCNQ1OT1与miR-125a-5p的特异结合以及miR-125a-5p和SMURF1蛋白的特异结合。过表达和敲低KCNQ1OT1和miR-125a-5p后,Western Blot验证SMURF1的表达以验证二者对SMURF1的调控作用;完成过表达KCNQ1OT1同时过表达miR-125a-5p、敲低KCNQ1OT1同时敲低miR-125a-5p后检测SMURF1表达情况的rescue实验验证KCNQ1OT1与miR-125a-5p的调控关系。结果:在结肠癌细胞培养上清中可分离并观察到外泌体,且在外泌体中检测到lncRNA KCNQ1OTl的表达;在结肠癌HCT-116和HT-29细胞中,过表达KCNQ1OT1能促进结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭;敲低KCNQ1OT1后,结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭受抑制;miR-125a-5p与KCNQ1OT1及SMURF1均能特异性结合;过表达KCNQ1OT1促进SMURF1的表达,敲低KCNQ1抑制SMURF1的表达;过表达miR-125a-5p抑制SMURF1的表达,敲低miR-125a-5p促进SMURF1的表达;过表达KCNQ1OT1的基础上同时表达miR-125a-5p能显著抑制SMURF1的表达,敲低KCNQ1OT1的基础上同时敲低miR-125a-5p能促进SMURF1的表达。结论:KCNQ1OT1存在于结肠癌培养上清分离的外泌体中。KCNQ1OT1通过KCNQ1OTl-miR-125a-5p-SMURF1调控轴,促进结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。