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目的:首先采用分子对接技术,初步筛选与丹红注射液(DHI)中主要效应成分和阿司匹林(Asp)亲和度较高的人细胞色素CYP450(CYPs)酶亚型;建立所筛选的亲和度较高酶亚型的人肝微粒体体外孵育体系,并采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间-串联质谱(UPLC-Q-TOF-MS/MS)中多选择反应监测(MRM)模式优化孵育条件,并验证该孵育体系的可行性;进一步采用优化的孵育体系研究DHI和Asp单用及其联合使用对筛选出的CYPs酶亚型活性的影响,探讨DHI与Asp的代谢性相互作用,为临床合理用药提供依据。方法:1.利用 Autodock 4.2软件,对DHI中主要效应成分(丹酚酸A、丹酚酸B、丹参素、迷迭香酸、原儿茶醛、原儿茶酸、咖啡酸、羟基红花黄色素A)、Asp分别与7种CYPs酶亚型(CYP1A2、CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4、CYP2B6、CYP2C19、CYP2C8)的晶体蛋白(2HI4、4JNM、5TFT、4D6Z、5UFG、4GQS、2NNJ)进行模拟对接,综合模拟对接所产生的自由能以及抑制常数(Ki)并进行排序,筛选出与DHI、Asp亲和力较高的CYPs酶亚型。2.以单个CYPs酶亚型为载体,以相应探针产物为检测指标,采用UPLC-Q-TOF-MS/MS中MRM模式测定探针产物的浓度,建立4种CYPs酶亚型的体外孵育体系。并针对每个CYPs酶亚型进行体外孵育体系条件的优化(人肝微粒体蛋白浓度、体外孵育时间、特异性探针的浓度)。分别计算4种CYPs酶亚型相应的阳性抑制剂的半数抑制常数(IC50),以验证建立孵育体系的可行性。3.采用UPLC-Q-TOF-MS/MS中MRM模式,分别测定不同体积百分比浓度的 DHI(0.4%、0.8%、1.6%)、不同剂量的 Asp(20、60、100 mg)单独给药及其联合给药(对其中一个药物进行预孵育一段时间后再加入另一药物)后4种CYPs酶亚型相应探针产物的生成量,综合比较DHI、Asp单用以及合用后探针产物生成量的差异。结果:1.CYP1A2、CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4 这 4 种酶亚型与 DHI中主要效应成分亲和度较高;2HI4与丹酚酸A、丹酚酸B、丹参素、迷迭香酸和羟基红花黄色素A有较低的自由能和抑制常数,其中最佳结合自由能分别为-34.42、-29.90、-33.12、-30.28、-27.35 KJ/mol,抑制常数分别为 0.93、5.70、1.56、4.95、16.19 μmol/L;4JNM 与丹酚酸 A、迷迭香酸有较低的自由能和抑制常数,其中最佳结合自由能分别为-25.62、-25.13 KJ/mol,抑制常数分别为 16.20、30.03 μmol/L;5TFT 与丹酚酸 A、丹参素、迷迭香酸有较低的自由能和抑制常数,其中最佳结合自由能分别为-27.85、-32.20、-29.90 KJ/mol,抑制常数分别为 13.07、2.25、5.76 μmol/L;4D6Z与丹酚酸A、丹参素、迷迭香酸和羟基红花黄色素A有较低的自由能和抑制常数,其中最佳结合自由能分别为-28.35、-28.48、-30.11、-28.48 KJ/mol,抑制常数分别为 10.63、10.19、5.28、10.22 μmol/L。2.色谱条件:ACQUITY UPLC(?)HSS T3 C18(2.1 mm× 100 mm,1.8μm)色谱柱;流动相为A-B(0.1%甲酸水-乙腈),梯度洗脱:0～4 min,B 30%～100%;4～5.5 min,B 100%;5.5～7.5 min,B 100%～30%;柱温30℃、流速0.4 ml/min;进样量:0.5 μL。质谱条件:电喷雾电离源(ESI),正离子(负离子)灵敏度模式,毛细管电压为2.5 kv(+)、2.80 kv(-),离子源温度为120℃,脱溶剂温度为550℃,锥孔气流量为50L/h,脱溶剂气流量为800 L/h。采用UPLC-Q-TOF-MS/MS中MRM模式,建立测定人肝微粒体体外孵育体系中对乙酰氨基酚、4-羟基双氯芬酸、右啡烷、1-羟基咪达唑仑以及IS生成量的方法,4种探针产物的线性关系良好(r>0.9941),日内及日间精密度均小于15%,各探针产物的回收率在75～100%范围内,待测探针产物基质效应在90～106%范围内,不影响准确定量,且稳定性良好。通过对孵育条件的优化,确定了 4种CYPs酶亚型合适的人肝微粒体体外孵育体系条件分别如下:人肝微粒体体外孵育体系的体积均为200μL,人肝微粒体蛋白浓度(0.5、0.7、1.0、0.6 mg/mL)、体外孵育时间(30、3 5、35、5 min)、特异性探针的终浓度(40.79、17.38、23 68、0.12 μmol/L)。4种CYPs酶亚型相对应阳性抑制剂的IC50分别为2.225、0.038、0.067、0.031 |μmol/L。3.DHI、Asp单用以及合用对4种CYPs酶活性的影响DHI 对 4 种 CYPs 酶亚型的活性(CYP1A2、CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4)均有抑制,抑制类型均为混合型。1)DHI、Asp单用组与空白组相比:低、中、高3个体积百分比浓度的DHI对CYP1A2、CYP2C9、CYP3A4酶亚型的活性均有显著的抑制作用,中、高体积百分比浓度的DHI对CYP2D6酶亚型的活性也有抑制作用;但低、中、高3个剂量的Asp对4种CYPs酶亚型的活性无影响。2)DHI + Asp组与空白组相比(将DHI进行预孵育):3个不同体积百分比浓度的DHI分别与3个不同剂量的Asp合用后,对CYP1A2酶亚型的活性均有抑制作用(p<0.05或p<0.01);高体积百分比浓度的DHI分别与3个不同剂量的Asp合用后对CYP2C9酶亚型的活性均有抑制作用(p<0.05);中、高体积百分比浓度的DHI分别与3个剂量的Asp合用后对CYP2D6酶亚型的活性均有抑制作用(p<0.05);中体积百分比浓度的DHI与高剂量的Asp合用后对CYP3A4酶亚型的活性有抑制作用(p<O.05)o3)Asp + DHI组与空白组相比(将Asp进行预孵育):3个不同剂量的Asp分别与中、高体积百分比浓度的DHI合用后对CYP1A2酶亚型活性均有抑制作用(p<0.05或p<0.01);仅有低剂量的Asp与高体积百分比浓度的DHI合用后,对CYP2C9酶亚型的活性有抑制作用(p<0.01);低剂量的Asp分别与中、高体积百分比浓度的DHI合用后,对CYP2D6酶亚型的活性均有抑制作用(p<0.05或p<0.01);中剂量的Asp与高体积百分比浓度的DHI合用后,对CYP2D6酶亚型的活性有抑制作用(p<O.05)o4)DHI + Asp组(将DHI进行预孵育)与相应体积百分比浓度的DHI单用组相比:CYP1A2:3个不同体积百分比浓度的DHI分别与不同剂量的Asp合用后,与相应体积百分比浓度的DHI单用组相比,无统计学差异(p<0.05)。CYP2C9:除了 DHI的中体积百分比浓度与高剂量的Asp合用后,与相对应的单用组相比有显著性外(p<0.01),其余均无统计学差异(p>0.05)。CYP2D6:3个不同体积百分比浓度的DHI分别与3个不同剂量的Asp合用后,与相应体积百分比浓度的DHI单用组相比均无统计学差异(p>0.05)。CYP3 A4:DHI的中体积百分比浓度组与高剂量的Asp合用后,与相应体积百分比浓度的DHI单用组相比有显著性差异(p<0.05)。5)Asp + DHI组(将Asp进行预孵育)与相应剂量的Asp单用组比较:CYP1A2:中、低剂量的Asp分别与低体积百分比浓度的DHI合用后,与相应剂量的Asp单用组相比均无统计学差异(p>0.05),而高剂量的Asp分别与3个不同体积百分比浓度的DHI合用后,对CYP1A2酶亚型活性均有抑制作用(p<0.05或p<0.01)。CYP2C9:与相应剂量的Asp单用组相比,低、中剂量的Asp分别与DHI的中、高体积百分比浓度合用后均有统计学差异(p<0.05或p<0.01),高剂量的Asp与高体积百分比浓度的DHI合用后有统计学差异(p<0.05或p<0.01)。CYP2D6:仅Asp的低、中剂量组分别与DHI的高体积百分比浓度合用后均有统计学差异(p<0.01)。CYP3A4:Asp的低、中、高3个剂量分别与高体积百分比浓度的DHI合用后,与相对应剂量的Asp单用组相比均有统计学差异(p<0.05或p<0.01)o但Asp的低、中、高3个剂量分别与低、中体积百分比浓度的DHI合用后,与相对应剂量的Asp单用组相比均无统计学差异(p>0.05)。结论:1.CYP1A2、CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4 这四个酶亚型与 DHI的亲和度较高,故为下一步体外孵育实验选取CYPs酶亚型提供依据。2.建立了 UPLC-Q-TOF-MS/MS中MRM模式定量检测人肝微粒体中对乙酰氨基酚、4-羟基双氯芬酸、右啡烷、1-羟基咪达唑仑以及IS(盐酸丁螺环酮、瑞格列奈)浓度的方法,该方法简单、快速、且灵敏度高;建立了 4种CYPs酶亚型合适的人肝微粒体体外孵育体系,该体系准确、可行。3.在临床常用剂量下,DHI对人CYPs酶亚型(CYP1A2、CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4)在体外均有抑制作用,而Asp对4种CYPs酶亚型的活性无影响。DHI +Asp合用与DHI单用相比对4种CYPs酶亚型的活性无明显影响,而Asp + DHI合用与Asp单用相比对4种CYPs酶亚型的活性存在不同的影响。综上所述,本实验初步探讨了 DHI与Asp单用及其联合使用对CYPs酶亚型活性的影响,为深入研究两者之间的代谢性相互作用奠定基础,为临床科学合理联合用药提供参考依据。