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原发性肾细胞癌是一种相对少见的恶性肿瘤，约占成人全部恶性肿瘤的2％-3％，但就泌尿外科而言，却较为常见。在国内，肾细胞癌仅次于膀胱癌占泌尿系恶性肿瘤的第二位，同时也是成人肾脏最常见的实性恶性肿瘤。然而，在众多的治疗方案中手术治疗被认为是其唯一有效的方法。除此之外的化疗及放疗方法，对于肾细胞癌的疗效仍然不太令人满意。其主要原因是肾细胞癌对于细胞毒性药物具有多重耐药性。但随着人们对于肿瘤血管发生在肿瘤的生长，侵袭，及转移过程中的重要作用的认识，抗血管生成这一新的治疗肿瘤方案已被提出，并引起众多医学工作者的兴趣。 Deutsch通过纯化一种中和肝素抗凝血活性因子，并将其命名为PF4。PF4属于细胞因子家族，是一种分子量为7.8kD的蛋白聚糖，由巨核细胞合成，以非共价四聚体的形式贮存在α颗粒中，由激活的血小板分泌。实验表明，人血小板因子4(PF4)具有较为明显的抑制肿瘤血管生成的作用。其主要机制可能与减弱VEGF、bFGF，及金属蛋白酶的促血管生长作用，并抑制p21基因的下调有关。 目的：本研究以含有hPF4 cDNA的重组载体转染人的GRC-1细胞，并观察了转染细胞的培养上清对于血管内皮细胞生长的影响，以及转染 第四军医大学硕士学位论文并观察了转染细胞的培养上清对于血管内皮细胞生长的影响，以及转染前后GRC一1细胞表达VEGF的变化。旨在揭示hPF4对于GRC一1细胞生长的抑制作用，为防治肾癌提供必要的实验依据。 方法:1真核表达载体peDNA3~PF4一55的构建及鉴定。将重组载体pEGFP一CI~PF4及质粒那DNA3一CD34一55在Bglll和BamHI内切酶及几DNA连接酶的作用下，将酶切下的hPF4 cDNA连接于载体peDNA3一cD34一55中，构建真核表达载体peDNA3~PF4一55，并用句In扭口mHI进行双酶切鉴定。 2 .GRC一l细胞的稳定转染及鉴定。取对数期生长的GRC一1细胞，通过脂质体介导，按hPofeeta而ne转染试剂盒中的说明书，以该载体稳定转染GRC一1细胞。挑选出抗G418阳性细胞，分别用400一1 Zoom留LS个药物浓度进行筛选，当药物浓度达到l。以〕协岁ful时，对照组细胞全部死亡，将转染后的GRC一1细胞进行扩大培养。根据hPF4基因的合成PCR引物。用RT一PCR对转染后的细胞进行鉴定。 3.转染前后GRC一1细胞中VEGF表达的检测。利用VEGF多克隆抗体对GRC一1~PF4及GRC一1细胞的细胞爬片进行免疫细胞化学染色，比较两者表达的强弱水平。 4.转染细胞培养上清对EvC304细胞生长的影响。取对数期生长的EvC304细胞，分成三组分别加人GRC一1~PF4，GRC一1细胞的培养上清及RPMll640培养液培养48小时。分别用细胞计数法和M竹比色法检测，并以SPLM统计软件，进行两组数据的t检验统计分析。 结果:1.真核表达载体peDNA3一PF4一ss的构建及鉴定。经过琼脂糖凝胶电泳分离，确定扩增片断的大小为250bP左右的特异性片段.此片段与文献报道的PF4的大小相一致，证明PF4一DNA已正确连接人peDNA3一cD34一55中，构建成peDNA3~PF4一55真核表达载体。 2.GRC一1细胞的稳定转染及鉴定。用RT一PCR从转染细胞中可扩增 4 第四军医大学硕士学位论文出约250bP的基因片段，而未转染的GRC一1细胞中则未见此扩增片段说明pcDNA3~PF4导人GRc一1细胞中，命名为GRc一1一hpF4细胞克隆。 3.转染前后GRC一1细胞中vEGF表达的检测。利用VEGF多克隆抗体对GRC一1一PF4及GRC一1细胞的细胞爬片进行免疫细胞化学染色，发现胞浆和胞膜染色均有VEGF表达，但GRC一1一PF4细胞中染色明显较GRC一1细胞减弱。表明转染PF4基因的GRC一1细胞中VEGF的表达受到抑制。 4.转染细胞培养上清对EVC304细胞生长的影响。与GRC一1细胞组相比较，细胞记数显示，用GRC一1一PF4细胞培养上清培养的血管内皮细胞数量(842.赶17.7)明显较少，两者有明显的差距(P<0 .05).而M竹比色法检测转染组的A值(0.55夕.02)明显低于GRC一1细胞组(0. 94却.02，P<0 .05)。 结论:以上研究表明转染hPF4 cDNA的GRC一1细胞培养上清中存在的PF4因子可通过直接或间接方式抑制血管内皮细胞生长。有研究表明，PF4可通过细胞内外途径阻止bFGF及VEGF与硫酸肝素结合，而阻断其受体激活。另外PF4还会阻止这两种因子的二聚化和内化，从而减弱它们的促血管生成作用。并且免疫组化染色显示，促血管生成的vEGF表达明显减弱，与文献报道的结果相符。说明转染细胞分泌的PF4具有抑制GRC一1细胞分泌的促血管生成因子(如bFGF、VEGF及MMP等)的作用，故肿瘤细胞的生长速度减慢。初步揭示hpF4对于GRC一1细胞生长的抑制作用，为防治肾癌提供必要的实验依据。探讨PF4的抑制血管生长的作用机理，以及如何提高PF4的抑制血管的效率可能成为今后研究的重点。