论文部分内容阅读
井冈霉素是我国自主研发并实现大规模产业化生产的第一个农用抗生素,主要由吸水链霉菌井冈变种(Streptomyces hygroscopicus var.jinggangensis)产生。它对防治水稻纹枯病具有特效,在亚洲的水稻产区需求量巨大。同时,井冈霉素及其衍生物可作为治疗II型糖尿病的药物阿卡波糖和伏格列波糖的合成前体,具有很高的经济附加值。鉴于其市场需求的不断攀升,利用代谢调控和基因工程手段来优化井冈霉素高产菌株的发酵性能,获得产量进一步提高的菌株,是本论文的研究重点。前期研究发现井冈霉素野生型菌株5008中存在三套同源的afsA-arpA代谢调控基因,组合缺失A因子受体基因shbR1和shbR3能明显上调valABC的转录水平,井冈霉素的终产量提高约40%。因此,我们首先通过缺失高产菌株TL01中shbR1和shbR3基因,促使井冈霉素的发酵产量分别提升14%和11%,在组合缺失菌株中井冈霉素的终产量由22.5 g/L提高到28 g/L。商品化的井冈霉素粗品通常包含约70%的A组分,15%的B组分,以及其他类似物。与有效成分A组分相比,B组分具有明显低效的抗病原真菌活性。前期研究推测ValE与ValJ蛋白可能催化A组分转化成B组分。在缺失valE基因后,突变株只产生少量的B组分;在缺失valJ基因后,突变株中B组分的含量与出发菌株相比减少了35%。并且不论是缺失valE基因,还是缺失valJ基因,对井冈霉素A的产量没有影响。由此,通过基因工程改造,我们成功实现了井冈霉素A组分的特异性积累。井冈霉素工业发酵中会产生大量的色素,48小时发酵液呈现深褐色,加大了下游分离纯化的难度,并影响了产品的色泽、产率和质量。为了消除发酵液中的色素,我们通过全基因组分析,在基因组中寻找到了四组可能参与色素合成的基因,分别参与以酪氨酸为前体的黑色素、III型聚酮合酶(以下简称为PKS)编码的黑色素、II型PKS编码的孢子色素、来源于尿黑酸的褐黄素的合成。通过对上述基因簇进行逐一中断,和出发菌株TL01相比,多巴类黑色素基因突变株PY06中井冈霉素的发酵产量提高了12%;III型PKS编码的黑色素基因簇突变株PY07产量无明显变化;II型PKS编码的孢子色素基因簇缺失和褐黄素基因缺失,分别导致井冈霉素产量下降11.7%和17.2%。所有突变株中井冈霉素基因簇转录水平和发酵液颜色均没有明显变化。基于上述改造过的高产菌株,我们进一步中断井冈霉素生物合成基因簇,成功构建了用于高效表达氨基环醇类化合物的异源宿主。一方面,我们将包含阿卡波糖天然合成基因簇的整合型质粒引入到阿卡波糖基因簇被中断的原始菌株Actinoplanes sp.SE 50/110(?acb)中,可以检测到阿卡波糖合成能力的恢复。但该基因簇在Streptomyces coelicolor M145和Streptomyces lividans 1326中的转录量极低,检测不到阿卡波糖的产生。这暗示可能存在未知的副调控基因抑制阿卡波糖天然合成基因簇的转录,或者缺乏激活该基因簇表达的正调控基因。另一方面,我们选用井冈霉素基因簇的温敏性启动子PvalA,并将阿卡波糖生物合成的17个可能必需基因进行串联组装,并将其引入上述的宿主中,检测各基因的转录水平。综上所述,本论文通过全基因组分析,对井冈霉素高产菌株TL01进行了系统地改造,得到了井冈霉素产量提高、有效成分A组分特异性积累的衍生菌株。同时尝试了天然的和人工重组装的阿卡波糖天然基因簇的异源表达,为异源高产阿卡波糖奠定了基础。