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鲶爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)是一种兼性的胞内寄生菌,为革兰氏阴性,属于肠杆菌科,可导致斑点叉尾鮰肠道败血病,在我国可引起鲶形目鱼类的疾病,如黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)头部的“一点红”或“头穿孔”。本研究通过对分离自患病黄颡鱼的鲶爱德华氏菌HSN-1株自带的两个质粒pEIl和pEI2序列的测定,发现其编码的蛋白中有与III型分泌系统(type Ⅲ secretion system, T3SS)同源的分子。本研究对质粒编码的EseH、EseI和EscD进行了在宿主细胞的定位及其致病性方面的研究。通过测序,发现质粒pEI1不含转座子,其编码的EseH和pEI2编码的EscD和EseI分别与T3SS蛋白有一定程度的相似性,其中EseH和EscD分别具有T3SS超家族PRK15372和PRK15336的保守结构域。而EseI在C-端与T3SS效应分子OspB有较低程度的相似性,因此推测这3个蛋白可能与鲶爱德华氏菌的致病性相关。由于pEI1和pEI2为多拷贝质粒,本研究利用同源质粒不相容原理对两个质粒分别进行彻底消除以构建目的基因缺失突变株,并检测了突变株对黄颡鱼的半数致死量(LD50)和体内竞争感染系数(Competitive Index, CI)。野生型HSN-1的LD50为105.4775(R2=0.9945),突变株△eseH和△eseI的LD50比野生型略高,分别为105.6567和105.8758,而△escD的LD50与HSN-1的LD50差别较小,为105.5497。△eseH和△eseI的CI在肝脏分别为0.7246和0.6373,在脾脏为0.7044和0.6158,均显著低于野生型(P<0.01),而△escD的CI则超过1.5,显著高于野生型(P<0.01)。用突变株感染鲤上皮瘤细胞(EPC),发现△eseH,△eseI以及pEI1-pEI2-与野生型相比其对EPC的粘附力降低,而△eseI和pEI1-pEI2-的侵袭能力则明显增强。比较突变株和野生型在黄颡鱼头肾巨噬细胞的繁殖,发现△eseH的繁殖力降低,△eseI在巨噬细胞内的繁殖受到抑制,最终被巨噬细胞清除,而△escD与HSN-1的差异不显著(P>0.05)。由于鲶爱德华氏菌与迟缓爱德华氏菌在T3SS的分子组成和基因排列方面都比较相似,本研究利用迟缓爱德华氏菌的T3SS检测这3种蛋白是否由该系统所分泌和转运。研究发现EseH和EseI可被分泌并转运进宿主细胞,EseH的分泌依赖转运相关的T3SS,而EseI则不依赖T3SS;被转运进入ZF4宿主细胞的EseH分布于细胞核外,定位于细胞的膜相,EseI定位于胞浆质相；而EscD不被T3SS所分泌。此外,通过酵母双杂交实验,证明EscD与EseH或EseI不存在蛋白与蛋白之间的结合作用,即EscD不是所报道的EseH或EseI的分子伴侣。综上所述,本研究对鲶爱德华氏菌HSN-1株质粒pEIl和pEI2的基因组进行了测序,通过构建突变株发现eseH、esel和escD皆为毒力基因,与细菌的粘附、侵袭及在鱼类细胞或鱼类个体内的繁殖密切相关；EseH和EseI可以被转运至宿主细胞内,有利于细菌在细胞内的繁殖。此外,本研究所采用的揭示质粒编码蛋白功能的方法将有助于进一步研究鲶爱德华氏菌质粒编码的其它蛋白的致病性。