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2002年11月至2003年6月,在全球20多个国家和地区爆发的严重的急性呼吸道综合征(severe Acute Respiratory Syndrome,SARS)是由一种新型的冠状病毒(coronavirus,CoV)引起的。SARS病毒是全基因组由29,727个核苷酸组成,具有11个开放阅读框,基因组结构与其它冠状病毒相似,基因序列与原先发现的冠状病毒的同源性不高,被列为冠状病毒科的新类型。其编码的蛋白质推测有23种,但对感染患病起重要作用的可能是5种关键蛋白:E蛋白、S蛋白、M蛋白、N蛋白、蛋白酶复合体,蛋白酶复合体分成14个蛋白,其中包括RNA依赖的RNA聚合酶(RNA DependentRNA Polymerase,RDRP)。SARS病毒的蛋白酶复合体编码区占基因组序列长度的2/3,相应的转录产物在翻译时利用特有的核糖体移框(ribosomal frame shifting)机制产生两个大小不同的ORF1ab和ORF1b编码框编码木瓜水解蛋白酶(papain-like proteinase,PLPpro)和3C样胰凝乳酶(3C-like proteinase,3CLpro),二者可自身水解消化成16个成熟的复制酶蛋白(亦非结构蛋白,nonstructural protein,nsp)。通过一系列生物信息学BLAST比对,在此16个非结构蛋白中发现RNA依赖性聚合酶(RDRP,nsp12)存在高度保守的稳定结构域,并且几乎所有的正链RNA病毒都编码有RNA依赖的RNA聚合酶,其中GDD基序高度保守的,可能与酶的催化功能相关。冠状病毒复制酶蛋白的合成是病毒在细胞中生命活动的开始,复制酶蛋白复合体及其水解产物对于病毒基因组的复制、亚基因组的转录以及翻译后的调节起到重要作用,而目前这种分子机制仍不清晰。本课题包括的研究内容有:1)首先利用两对引物从SARS-CoV cDNA扩增出RDRP基因的全长,分别克隆入真核表达载体pCMV-Myc和原核表达载体pGEX4T-1。2)真核表达RDRP蛋白并研究其细胞定位。3)原核诱导GST-RDRP融合蛋白,并纯化此蛋白,为了进一步研究RDRP蛋白的功能做准备。4)利用PCR定点突变技术将GDD突变为ADD,即将甘氨酸突变为丙氨酸,并构建突变ADD的真核和原核表达载体pCMV-Myc-M-Pol and pGEX-4T-1-M-Pol。5)原核诱导突变型GST-RDRP融合蛋白,并纯化此蛋白,为下一步比较野生型和突变型GST-RDRP体外合成RNA的功能作准备。本实验中,通过pCMV-Myc-Pol转染293细胞,用Western-blot方法检测到其成功表达,并在共聚焦显微镜下观察蛋白在293细胞的定位;通过构建pGEX4T-1-Pol和pGEX4T-1-M-Pol,在大肠杆菌中成功地诱导了带有GST标签的野生型和突变型重组蛋白,诱导表达后纯化得到野生型和突变型GST-RDRP重组蛋白。结论:成功构建的真核表达载体,在真核细胞中过表达的RDRP蛋白主要定位在细胞质。成功构建表达突变型和野生型RDRP融合蛋白的原核表达载体,在大肠杆菌内高效表达,纯化后得到分子量约为116kDa的野生型和突变型GST-RDRP融合蛋白,为进一步探讨RDRP的功能奠定基础。