有研究发现胃饥饿素(Ghrelin)在保护胰岛β细胞方面有作用,它可以减少胰岛细胞在长期高糖、高脂状态下的凋亡,增加细胞活性。另一方面,ghrelin也被用于细胞自噬方面的研究,它可以诱导保护性自噬,保护心肌细胞免受氧化应激缺氧损伤,在癌细胞研究方面又可通过诱导自噬来抑制癌细胞的扩散。总的来说,ghrelin对胰岛β细胞有保护性,但这种保护性是否与自噬相关,及ghrelin对胰岛β细胞是否有促自噬作用并不清楚,若其有促自噬作用,那么又是否能通过这一作用来降低凋亡的发生?因此本实验想通过构建体外高糖高脂环境诱导细胞凋亡模型来研究(1)ghrelin是否能增强细胞的自噬作用;(2)ghelin在保护胰岛细胞方面是否与其促细胞自噬作用相关;(3)ghrelin在调节高糖高脂环境下细胞的凋亡及自噬间的相互作用。为临床保护胰岛功能功能和糖尿病的用药提供新的实验理论基础。第一部分高糖高脂诱导胰岛NIT-1细胞凋亡模型构建目的:构建体外高糖高脂环境诱导细胞凋亡模型,为后续实验提供基础。方法:以葡萄糖和棕榈酸PA构建体外高糖高脂环境诱导细胞凋亡模型,分组为:正常对照组(葡萄糖5.6 mmol/L+0.5%BSA)、高糖高脂模型组(葡萄糖33.3 mmol/L+0.5%BSA+0.5 mmol/LPA)。检测凋亡模型是否构建成功:(1)用CCK-8检测胰岛细胞增值的活性。(2)用Annexin V-FITC/PI染色和流式细胞术检测细胞凋亡率。(3)Hoechst 33258染色标记细胞核观察细胞凋亡形态。(4)qPCR测定各组Bcl-2、BaxmRNA表达量的变化。结果:高糖高脂诱导细胞凋亡模型成功,(1)通过CCK活性检测显示,高糖高脂组比正常对照组细胞活性减少(P<0.05)。(2)Annexin V-FITC/PI双染测定细胞总凋亡率及Hoechst 33258显示,与正常对照组比较,高糖高脂组凋亡增加(P<0.05)。(3)高糖高脂诱导后下调Bcl-2表达(P<0.05),上调Bax表达(P<0.05)。结论:通过33.3 mmol/L浓度葡萄糖和0.5 mmol/L棕榈酸构建高糖高脂环境诱导胰岛β细胞凋亡模型成功,为后续实验提供基础。第二部分 Ghrelin对糖脂毒性下胰岛β细胞凋亡及自噬的影响目的:探讨ghrelin对胰岛β细胞凋亡及自噬的作用。方法:首先构建体外高糖高脂环境诱导细胞凋亡模型,并以ghrelin干预分为不同处理组:正常对照组(葡萄糖5.6mmol/L+0.5%BSA)、ghrelin对照组(葡萄糖 5.6 mmol/L+0.5%BSA+100nmol/L ghrelin)、高糖高脂模型组(葡萄糖33.3 mmol/L+0.5 mmol/LPA)、高糖高脂+ghrelin处理组(葡萄糖 33.3 mmol/L+0.5 mmol/LPA+100 nmol/L ghrelin)。(1)用 CCK-8 检测胰岛细胞增殖活性。(2)检测凋亡:Annexin V-FITC/PI双染流式检测凋亡率,Hoechst33258 染核,qPCR 测 Bcl-2、BaxmRNA 表达。(3)检测自噬:MDC自噬空泡荧光染色,自噬蛋白LC3B免疫荧光,电镜检测自噬体,Western Blot检测各处理组自噬相关蛋白Beclin-1,P62,LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ转化率,qPCR检测Atg6、LC3B mRNA表达。结果:(1)正常对照组与ghrelin对照组细胞活性无显著差异;与高糖高脂组比较,高糖高脂+ghrelin组细胞活性增加(P<0.05)。(2)Annexin V-FITC/PI双染测定细胞总凋亡率及Hoechst 33258显示,与正常对照组比较,ghrelin对照组细胞凋亡减少(P<0.05),但Bax、Bcl-2表达无显著差异。在高糖高脂基础上,ghrein应用后细胞凋亡降低(P<0.05),上调Bcl-2表达(P<0.05),下调Bax表达(P<0.05)。(3)MDC染色及自噬蛋白LC3B免疫荧光及电镜结果显示,与正常对照组比较,ghrelin对照组及高糖高脂组自噬增加。高糖高脂组Beclin-1蛋白,LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ转化率,P62蛋白及Atg6、LC3B mRNA表达均增加(P<0.05);ghrelin对照组Beclin-1蛋白表达增加(P<0.05)。与高糖高脂组比较,高糖高脂+ghrelin组自噬进一步增加。Ghrelin上调糖脂毒性下细胞Beclin-1蛋白,LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ转化率及Atg6、LC3B mRNA表达(P<0.05),P62蛋白表达无统计学差异。结论:(1)高糖高脂诱导细胞凋亡发生的同时使细胞自噬增强,可能与其自噬启动产生增多和降解减少相关。(2)ghrelin可抑制高糖高脂诱导的细胞凋亡,对细胞产生保护作用,避免糖脂毒性损伤。(3)ghrelin对正常条件下的胰岛细胞自噬无影响,但会加强糖脂毒性作用下的细胞自噬。第三部分 自噬在ghrelin抗胰岛β细胞凋亡中的作用目的:研究ghrelin在调节糖脂毒性下细胞的凋亡及自噬间的相互作用。方法:以ghrelin和氯喹CQ干预糖脂凋亡模型分为不同处理组:高糖高脂模型组(葡萄糖33.3 mmol/L+0.5 mmol/LPA)、高糖高脂+ghrelin处理组(葡萄糖 33.3 mmol/L+0.5 mmol/LPA+100 nmol/Lghrelin)、高糖高脂+CQ 处理组(葡萄糖 33.3 mmol/L+0.5 mmol/LPA+25 μmol/LCQ)、高糖高脂+ghrelin+CQ 处理组(葡萄糖 33.3 mmol/L+0.5 mmol/LPA+100 nmol/L ghrelin+25 μmol/LCQ)。分别检测细胞活性,凋亡,自噬情况,方法同第二部分。结果:氯喹抑制细胞活性,逆转ghrelin对细胞的保护性。应用自噬抑制剂氯喹后细胞自噬被阻断,表现自噬泡、溶酶体及自噬蛋白LC3B的堆积,P62表达增加。由于自噬降解途径被阻断,联合应用ghrelin和氯喹后,相较于高糖高脂+ghrelin组,细胞凋亡增加,活性下降,ghrelin的抗凋亡作用被抑制。结论:当ghrelin的促自噬作用被阻断时细胞凋亡增加,有理由认为ghrelin对胰岛β细胞自噬的促进作用可调节其对抗糖脂毒性诱导的细胞凋亡。