论文部分内容阅读
日本脑炎(Japanese Encephalitis, JE),又称流行性乙型脑炎(Epidemic Encephalitis B),是由日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus, JEV)引起的以中枢神经系统损害为主的急性传染病。猪作为日本脑炎传播的中间扩增宿主,带毒蚊子通过叮咬将感染性病毒传播给人。该病在我国流行面积较大,对养猪业的危害巨大,近年来经济损失较为严重,因此预防猪感染本病是防止人患乙脑的重要措施。目前对乙型脑炎的治疗仍然没有行之有效的方法,而且对待本病主要还是以免疫接种疫苗的方式进行预防。寻求稳定、安全的猪用乙脑疫苗,已经成为近年JEV感染防治的主要研究方向。目前关于表位疫苗的设计策略取得了较大的研究进展,作为理想的免疫原,抗原分子中应同时包含目的抗原B细胞表位和自身或外源T细胞表位,才能诱导出高特异性的细胞及体液免疫应答,从细胞免疫和体液免疫水平起到预防或治疗作用,赋予较广泛的保护性。因此表位疫苗成为近年来病毒新型疫苗研究的热点。法氏囊(bursa of Fabricus, BF)是禽类独有的中枢免疫器官,其功能与哺乳动物中的骨髓类似。三肽囊素作为BF组织中分离的活性分子,无种属特异性,不仅对禽类具有免疫调节功能,而且对哺乳动物及人类淋巴细胞也具有明显的免疫学及生理学活性。法氏囊五肽为BF组织中分离的又一活性分子,对禽类具有明显的免疫调节功能。本研究利用基因重组技术,把日本脑炎病毒E蛋白上的多表位基因(MEP)、囊素样肽基因和法氏囊五肽基因分别串联起来,构建三种原核表达载体,在大肠杆菌表达系统中表达。表达的融合蛋白纯化后免疫小鼠,研究三者的免疫原性及保护效力,希望为研制具有高免疫原性的改良的乙脑表位疫苗提供依据。具体的研究内容如下：1串联表达JEV E蛋白多表位基因、囊素样肽及法氏囊五肽利用PCR扩增出含日本脑炎病毒(JEV)E蛋白6个B细胞表位(氨基酸残基分别位于75-92,149-163,258-285,356-362,373-399,397-403),2个T细胞表位的基因(氨基酸残基分别位于60-68和436-445),即JEV E蛋白多表位基因(MEP),用EcoRl和Xhol双酶切将其连接到pET-28a(+)载体中,构建含MEP基因的重组原核表达载体。由于囊素样肽(Bur sin-like peptide, BSA)能增强乙脑亚单位疫苗的免疫反应,在本研究中还构建了一个在大肠杆菌中表达的重组载体,将JEV E蛋白多表位基因(MEP)按正确的读码框与囊素样肽基因串联,构建含MEP-BSA基因的重组原核表达载体。此外,法氏囊五肽(Bursopentine, BP5)为本组从鸡法氏囊中新分离的一种活性肽,为了弄清其免疫佐剂效应,本研究将JEV E蛋白多表位基因(MEP)、囊素样肽基因按正确的读码框与法氏囊五肽基因串联,构建另一个融合表达载体pET-MEP-BSA-BP5。将三种重组表达载体在大肠杆菌BL21中诱导表达,以His-Bind螯合层析柱纯化三种融合蛋白(rMEP、rMEP-BSA、rMEP-BSA-BP5),然后运用SDS-PAGE进行可溶性分析,利用Western Blotting对该融合蛋白进行了鉴定。结果表明：三种融合蛋白均以包涵体的形式获得了高效表达。通过His-Bind螯合层析柱纯化后的三种融合蛋白,通过Western Blotting鉴定其具有良好的抗原性。2重组蛋白rMEP、rMEP-BSA、rMEP-BSA-BP5对小鼠特异性免疫的影响4-6周龄雌性BALB/c小鼠随机分成5组,每组10只。将50μg的rMEP、 rMEP-BSA、rMEP-BSA-BP5三种融合蛋白(用100μl PBS稀释)分别以肌肉注射接种的方式给小鼠进行3次免疫,同时设两组对照组小鼠,分别是PBS和JEV弱毒疫苗(SA-14-14-2病毒株)。通过检测中和抗体、抗体亚型(IgG1和IgG2a)、淋巴细胞增殖、INF-y和IL-4细胞因子的表达水平、T细胞亚型、攻毒实验发现,使用rMEP、 rMEP-BSA、rMEP-BSA-BP5三种融合蛋白都能明显的提高小鼠的特异性免疫反应。IgG1和细胞因子IL-4水平表明rMEP蛋白主要刺激Th2型免疫反应。而rMEP-BSA和rMEP-BSA-BP5蛋白既能刺激Th2型免疫反应,也能刺激Thl型免疫反应。然而,Thl型免疫反应明显低于JEV弱毒疫苗但高于rMep蛋白,rMEP-BSA和rMEP-BSA-BP5两个蛋白产生的免疫反应很相似。攻毒实验结果表明]MEP、 rMEP-BSA、rMEP-BSA-BP5与弱毒苗一样都能保护小鼠免受致死量的乙脑病毒的感染,且保护率均为100%,证明rMEP、rMEP-BSA、rMEP-BSA-BP5三种融合蛋白具有较好的免疫原性,这为下一步猪体免疫试验奠定了基础。由此也可以看出囊素样肽联合多表位抗原可以提高小鼠的免疫反应,而法氏囊五肽的增强作用不是很明显。因此rMEP、rMEP-BSA可以作为候选的基因工程亚单位疫苗。