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由小麦专化型条形柄锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)引起的小麦条锈病是小麦生产上的一种重要的真菌病害。目前,生产上主要通过抗病品种的应用并辅以药剂来防治该病害。然而,由于小麦条锈菌毒性的频繁变异产生新的毒性小种,导致现有小麦品种的抗病性降低;同时化学药剂的大量使用容易造成环境污染。因此,寻找新的抗病策略及创制新的持久抗病材料对小麦条锈病的持久控制具有重要的理论和实践意义。寄主诱导的基因沉默(Host-Induced Gene Silencing,HIGS)技术是在RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术可提高植物抗病性的基础上发展起来的,它既可以从反向遗传学方向鉴定植物专性寄生病原菌的基因功能,又可以通过构建HIGS载体培育转基因抗病作物,因而成为一种全新的了解植物病原物与寄主互作和控制病害的工具。然而,利用HIGS技术实现小麦对条锈病高效持久抗性的研究尚未见报道。本研究在小麦条锈菌全基因组测序的基础上,对真核生物中进化上保守的一类MAPK级联途径激酶基因开展研究,明确了它们在小麦条锈菌侵染、定殖及致病中的作用;并在此基础上,构建了小麦条锈菌中MAPKK基因PsFUZ7的RNAi载体,利用HIGS技术赋予了小麦对条锈菌的稳定持久的抗病性。获得的主要结果如下:1.对小麦条锈菌全基因组数据库进行深入分析,获得七个FUS3/Kss1类MAPK级联途径候选基因。其中包括:PsUBC2(adaptor protein)、PsKPP4(MAPKKK)、PsFUZ7(MAPKK)、PsKPP2、PsKPP6和PsCRK1(MAPK)、PsPRF1(Transcription factor,TF)。转录表达分析表明,除PsKPP2外,其余相关基因在小麦条锈菌侵染前期均上调表达,暗示这6个MAPK相关基因可能在病菌前期的侵染定殖和菌丝蔓延过程中发挥着重要的作用。酵母双杂交实验表明,MAPK级联途径基因的相互作用在小麦条锈菌中是保守的。利用病毒介导的基因瞬时沉默(Virus-Induced Gene Silencing,VIGS)技术发现,瞬时沉默PsKPP4、Ps FUZ7、PsKPP6、PsCRK1和PsPRF1基因后,条锈菌致病力均有不同程度的减弱,但沉默PsFUZ7后的表型最为显著,说明这些基因不同程度参与到调节小麦条锈菌生长发育和致病性的过程中,而PsFUZ7可能处于其核心位置。2.前期VIGS结果表明PsKPP4基因可能在侵染过程中发挥重要作用,因此我们对PsKPP4激酶基因进行进一步的功能分析。通过生物信息学分析发现PsKPP4有典型的磷酸化位点。酵母双杂交实验发现PsKPP4中的SAM(Sterilealpha Motif)结构域在PsKPP4与PsUBC2的互作中发挥着重要作用。原生质体定位结果证实PsKPP4激酶蛋白定位于细胞质中。PsKPP4能够部分恢复稻瘟菌突变体mst11附着胞的形成及致病性,说明PsKPP4有一定的功能保守性。酵母中过表达PsKPP4基因后对外界胁迫的抗性与对照相比有所提高。在烟草中表达PsKPP4可以抑制BAX诱导产生的细胞程序性死亡过程(PCD),表明它们具有潜在的抑制植物防卫反应的功能。利用VIGS瞬时沉默PsKPP4后,条锈菌致病力减弱,产孢量下降。这些结果表明PsKPP4是条锈菌重要的致病因子,是MAPK级联途径参与到调控菌丝发育和致病性过程中的重要基因。3.序列分析发现转录因子PsPRF1是一个具有HMG结构域的蛋白。进一步研究发现它可以诱导植物和酵母菌的细胞坏死,并且具有核酸酶的活性。推测PsPRF1功能可能是一方面调节真菌自身的凋亡;另一方面参与到降解植物DNA的过程当中。PsPRF1的具体功能还需要进一步的实验探索。4.生物信息学分析表明PsFUZ7是一个典型的MAPK激酶,有着保守的磷酸化位点。互补实验发现,小麦条锈菌PsFUZ7能够部分恢复稻瘟菌突变体mst7附着胞的形成及致病性。酵母中过表达PsFUZ7后,酵母细胞呈现纺锤状且发生凝聚,并对外界胁迫的抗性显著高于对照,而且细胞核呈弥散状。用U0126抑制剂处理小麦条锈菌夏孢子后,孢子芽管的萌发受到抑制;接种到小麦叶片后,条锈菌产孢减少且不易散开。利用VIGS瞬时沉默PsFUZ7后,小麦条锈菌致病力明显减弱。组织学观察发现,沉默植株中条锈菌的菌丝在生长发育不同的时间点均受到抑制。5.根据功能分析结果选取PsFUZ7作为靶标基因构建小麦稳定的HIGS转基因材料。利用pAHC25-PsFUZ7系统构建RNAi载体,通过基因枪轰击方法得到小麦转基因株系。在阳性植株上接种小麦条锈菌进行抗病性鉴定,结果发现小麦条锈菌扩展能力和产孢量显著降低,小麦叶片产生坏死现象。证明携带HIGS载体的转基因植物可以产生siRNA干扰PsFUZ7靶基因,从而限制真菌生长并降低其致病力。为验证脱靶现象(Off-target),生物信息学分析小麦和小麦条锈菌转录组中存在的1-3nt错配的潜在靶标,并挑选最可能的基因进行定量分析。结果显示,这些基因在转基因株系中的表达量并未出现明显的下调,证明选取的这段序列是控制小麦条锈菌的理想靶标。本研究为全面深入研究小麦条锈菌的致病机理奠定了基础,并初步揭示了RNAi技术可以应用于小麦与小麦条锈菌互作的体系中来,为小麦条锈菌的持续防治提供了新的策略。本策略在小麦条锈病上的突破将推动小麦抗锈病的种质创新,并为HIGS技术在植物防控真菌病害的运用中提供了重要的理论依据和技术支撑。