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目的心肌缺氧损伤广泛存在于严重烧(创)伤、心血管疾病等多种疾病病程中。严重烧伤后在有效循环血量显著减少之前,即可发生心肌损害和功能减退,其机制尚不清楚。缺氧后细胞骨架的改变及其调节机制是近年来本领域的研究热点。微管是细胞骨架的重要组成部分,本研究旨在明确缺氧早期心肌细胞微管的改变,并探讨其原因和调控机制。材料和方法1、体外培养SD大鼠乳鼠心肌细胞,以HeLa细胞为对照,分为常氧、缺氧15min、30min、60min组。观察缺氧后微管和细胞活力的变化:α-微管蛋白免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜观察微管结构改变;提取聚合/游离态微管蛋白,WB半定量;CCK-8法检测细胞活力。2、观察缺氧后MAP4、Op18蛋白表达和活性(磷酸化)的变化。3、用不同的激酶抑制剂筛选缺氧时调节微管结构的激酶,检测缺氧时该激酶活性的变化。4、通过抑制剂/重组腺病毒载体抑制/激活筛选出的激酶,观察MAP4、Op18磷酸化、微管结构和细胞活力的改变。5、免疫共沉淀和免疫荧光共定位检测MAP4和筛选出的激酶间的相互作用。结果1、缺氧15min心肌细胞微管排列紊乱、部分断裂;缺氧30min微管变稀疏、断裂增加,聚合态微管蛋白减少;缺氧60min微管呈片段状改变,聚合态微管蛋白进一步减少;与心肌细胞相比,HeLa细胞聚合态微管蛋白下降更快、幅度更大;两种细胞活力均随缺氧时间延长逐渐下降。2、在心肌和HeLa细胞中,缺氧时MAP4(Ser 768)磷酸化增加、活性降低,Op18(Ser 16)磷酸化减少、活性升高。3、在p38/MAPK、PI3K/Akt和GSK-3β三种激酶中,只有p38/MAPK抑制剂可以使缺氧细胞微管结构好转,PI3K/Akt和GSK-3β抑制剂使微管破坏加重;缺氧后15min, p38/MAPK激酶即已激活,缺氧30min时激酶活性进一步升高并持续到缺氧60 min;缺氧后p38/MAPK激活与MAP4磷酸化的变化趋势一致。4、在心肌和HeLa细胞中,p38/MAPK抑制剂SB203580 (5μM)作用后,缺氧细胞MAP4(Ser 768)磷酸化减少、活性增加,Op18(Ser 16)磷酸化增加、活性降低,微管结构好转,聚合态微管蛋白增加,细胞活力回升;MKK6(Glu)高表达使p38/MAPK持续激活后,MAP4(Ser 768)磷酸化增加、活性降低,Op18(Ser 16)磷酸化减少、活性增加,微管解聚,聚合态微管蛋白降低,细胞活力下降。5、免疫共沉淀和免疫荧光共定位提示MAP4和p38/MAPK之间有相互作用,p38/MAPK可能是MAP4的上游激酶。结论缺氧激活p38/MAPK激酶,导致MAP4(Ser 768)磷酸化增加、活性降低,Op18(Ser 16)磷酸化减少、活性增加,二者协同作用引起微管解聚和结构破坏。抑制缺氧细胞p38/MAPK激酶可改善微管结构,提高细胞活力。这种现象和调控机制在心肌细胞和HeLa细胞中具有普遍意义。研究结果在一定程度上阐明了严重烧伤后在有效循环血量显著减少之前,即发生心肌损害和功能减退的机制。