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可可脂是生产巧克力和部分化妆品的原料,是从可可豆中提取获得的。近年来,可可脂需求增加;但可可树是热带植物,种植面积有限,导致可可脂供应短缺,价格上涨,急需寻找其他的可可脂来源。可可脂主要由16碳和18碳脂肪酸组成,且以1,3-二棕榈酰基-2-油酰基甘油（POP,C16:0–C18:1–C16:0）,1-棕榈酰基-3-硬脂酰基-2-油酰基甘油（POS,C16:0–C18:1–C18:0）和1,3-二硬脂酰基-2-油酰基甘油（SOS,C18:0–C18:1–C18:0）等三种甘油三酯形式存在。酿酒酵母是广泛应用于植物天然产物合成的模式微生物,且其脂肪酸主要由16碳和18碳脂肪酸组成,具有合成代可可脂的潜力。但酿酒酵母中POP,POS和SOS的比例较低,需对酿酒酵母的脂类代谢途径进行代谢工程改造,建立高效的合成代可可脂和酿酒酵母工程菌株。植物的脂类合成代谢途径主要在质体和内质网完成,甘油三酯储存于脂体内。植物脂类合成时,在质粒中起始合成的前体为乙酰辅酶A和丙二酰载体蛋白;经过多步反应后,生成脂肪酸,并转运至内质网,进而在延伸酶和去饱和酶的作用下,合成多种不同类型的脂肪酰辅酶A。脂肪酰辅酶A和甘油-3-磷酸在甘油-3-磷酸转酰酶（GPAT）,磷酸酯酰转移酶（LPAT）和二酰基甘油酰基转移酶（DGAT）等酶的作用下,合成不同类型的甘油三酯。与植物脂类合成代谢途径不同,酿酒酵母甘油三酯合成主要在细胞质内完成。酿酒酵母脂类合成的前体为乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A;在多种酶作用下生成不同类型脂肪酰辅酶A后,再经GPAT、LPAT和DGAT等酶作用,合成甘油三酯。在控制酿酒酵母合成脂肪酰辅酶A链长和饱和度的基础上,GPAT、LPAT和DGAT决定了酿酒酵母合成甘油三酯的类型及含量。其中,DGAT基因的过表达还能大幅增加酿酒酵母合成甘油三酯的能力。自然界含有多种油料作物和产油酵母,有望从这些高产油物种中挖掘到高产代可可脂的基因。通过下载Uniport数据库中的GPAT、LPAT和DGAT基因,利用系统发育学方法对其中的植物和部分其他物种来源的GPAT、LPAT和DGAT基因进行分类,用于筛选可能的与高产油脂相关的基因。合成或克隆了三个DGAT基因及产油酵母Trichosporon oleaginosus（又名Cutaneotrichosporon oleaginosus）的GPAT、LPAT和DGAT基因（Ah DGAT,Gm DGAT,and Rc DGAT）;添加高强度启动子和终止子后,将这些基因或其基因组合连接入载体,转化至IMX581、Y29、YJZ45、Y&Z019和Y&Z036等5个酿酒酵母菌株（包括部分高产脂肪酸酵母菌株）,最终获得27个酿酒酵母工程菌株。在对获得的27个酵母菌株生长速度分析的基础上,选取了11个酵母菌株进行了脂质组学分析。对这些酿酒酵母菌株的脂肪酸、甘油三酯等进行分析后,发现在酿酒酵母中表达DGAT等基因提高了酿酒酵母合成代可可脂的能力。与已有高产代可可脂的菌株相比,获得的菌株的代可可脂合成能力更强。这些菌株中的代可可脂含量较高,特别是Y&Z019-To DGAT等菌株的代可可脂含量超过了其甘油三酯的20%。在这些菌株中,YJZ45-Gm DGAT的代可可脂合成能力最强,其代可可脂产量是其他菌株的数倍,也显著高于文献报道中的产量。YJZ45等菌株和部分高效基因有望为未来代可可脂的合成提供基础。本研究基于系统发育分析等基因挖掘方法,获得部分代可可脂合成的关键酶基因,并构建了一些高产代可可脂的菌株。在现有基础上,持续应用合成生物学技术对酿酒酵母或产油酵母进行重编程,进一步提高酵母合成代可可脂的滴度、速率和产量,有望实现酵母合成代可可脂的工业化生产。