论文部分内容阅读
蛋白质间的相互作用存在于机体的各个细胞生命活动过程。基因的复制、转录、蛋白质的翻译、剪切、分泌以及细胞周期的调控、信号转导、物质代谢等生命过程均受到蛋白质间相互作用的调控。蛋白质间相互作用的顺利进行是细胞正常生命活动的保障。因此,研究蛋白质间的相互作用具有十分重要的意义。RACK1(Receptor for Activated C Kinase 1, RACK1)被认为是一种支架蛋白,在细胞信号转导中具有重要的作用。异三聚体GTP结合蛋白(heterotrimeric GTP- binding protein, G蛋白)是活细胞内一类具有重要生理调节功能的蛋白质。RACK1和AGB1蛋白都属于WD-40蛋白家族,两者具有相似的结构。RACK1和Gβ参与了植物许多生理、生化及对环境胁迫的响应过程。在动物中RACK1和Gβ间存在相互作用。那么,植物RACK1和Gβ间是否也像哺乳动物细胞中的情况一样存在相互作用,阐明这一科学问题对深入了解植物RACK1和Gβ的调节机制具有重要的科学意义。本实验首先利用大肠杆菌表达系统成功将编码拟南芥RACK1和AGB1蛋白的基因克隆到表达载体上,通过IPTG诱导分别使拟南芥RACK1和AGB1蛋白得到了有效表达,为进一步获得拟南芥RACK1和AGB1蛋白抗体奠定基础。在此基础上,还用GST pull down和酵母双杂交技术验证了拟南芥RACK1和AGB1蛋白不存在相互作用。研究结果表明:(1)将编码拟南芥RACK1蛋白的基因克隆到质粒pGEX-6P-1上,构建表达质粒pGEX-6P-1/AtRACK1,表达量占菌体总蛋白的32%;通过表达条件的优化,采用0.1mM IPTG浓度、24℃为最佳表达条件。SDS-PAGE电泳分析其可溶性,结果表明约50%的融合蛋白可溶。选择上清依次过谷胱甘肽-琼脂糖树脂亲和层析柱和Sephadex-G100凝胶柱纯化,纯度达95%。(2)将编码拟南芥G蛋白β亚基的基因克隆到质粒pET32a上,构建表达质粒pET32a/AGB1,表达量占菌体总蛋白的35%;通过表达条件的优化,采用0.1mM IPTG浓度、24℃为最佳表达条件。SDS-PAGE电泳分析其可溶性,结果表明融合蛋白全部以包涵体形式存在;将含有表达质粒pET32a/AGB1的菌体蛋白进行超声波破碎,离心后得到包涵体沉淀。分别用Triton X-100和1M的尿素洗涤包涵体,包涵体蛋白经8M尿素变性后,采用分步透析法使变性蛋白复性。将复性后得到的蛋白进行柱层析分离纯化,纯度达88%。(3)在本实验的表达系统中,AtRACK1蛋白收率为9mg/L发酵液,AGB1蛋白收率为2.1 mg/L发酵液。(4)应用离体(GST pull down)和活体(酵母双杂交技术)蛋白相互作用技术分析了拟南芥RACK1和G蛋白β亚基(AGB1)间的相互作用,结果表明,两者之间不存在相互作用。