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抑制素(inhibin，INH)是由绵羊的卵巢颗粒细胞和睾丸支持细胞分泌的糖蛋白质激素，它是由一个α亚基和一个β亚基通过二硫键构成的，其中抑制素α亚基（INHA）是抑制素发挥生理功能必不可少的。抑制素能抑制雌性动物促卵泡素(FSH)的释放，调节卵泡的生成；对雄性动物表现为抑制精子的发生，降低睾丸的生精能力。可见，可通过抑制抑制素α亚基基因的表达，来降低动物体内的抑制素水平，从而促进卵泡发育和精子的生成，继而提高动物的繁殖力。RNA干扰技术是内源性或外源性双链RNA诱发的mRNA水平上的基因沉默技术，具有高度的特异性。然而，根据以前的研究报告显示shRNA表达载体只能转录生成一种特异性的小干扰RNA，来阻断单一靶点的表达，干扰效率比较低。为了提高shRNA的干扰效率，我们在一个载体上插入两个靶点shRNA表达序列，即构建含有双启动子的shRNA表达载体，并将其与单个靶点shRNA载体的干扰效率作比较。本研究利用RNA干扰技术，根据绵羊INHA基因的cDNA序列设计构建shRNA重组质粒，通过双重PCR方法扩增启动子序列，构建含有U6和H1双启动子的不同靶特异干扰序列shRNA表达载体pGenesil1.2-INHA1+2，单个靶特异性序列的单启动子表达载体pGenesil1.2-INHA以及不针对任何序列的阴性对照重组质粒pGenesil1.2-HK。用lip2000将阴性对照、pGenesil1.2-INHA、pGenesil1.2-INHA1+2分别转染到绵羊的卵泡颗粒细胞中，用荧光定量PCR的相对定量法来检测转染了48小时后，各样品瞬时转染后基因的表达量，计算干扰的效果。western blot检测转染细胞INHA的蛋白表达情况。结果如下：1.酶切结果显示，试验成功的构建了双启动子shRNA表达载体pGenesil1.2-INHA1+2和单启动子表达载体pGenesil1.2-INHA。2.各重组质粒表达载体转染绵羊卵泡的颗粒细胞，瞬时转染48h荧光定量PCR检测结果显示，实验组与对照组相比，构建的shRNA表达载体pGenesil1.2-INHA，pGenesil1.2-INHA1+2对INHA基因都有抑制作用，其中双启动子表达载体pGenesil1.2-INHA1+2抑制效率较高，基因沉默达到83%。3.western blot检测结果显示，在干扰作用下，细胞中蛋白的表达与空白对照组和阴性对照组相比明显减少，与对照组相比，实验组pGenesil1.2-INHA，pGenesil1.2-INHA1+2细胞中INHA荧光蛋白的表达量都有降低，而这两组相比，pGenesil1.2-INHA1+2的荧光蛋白表达量降低更加明显。结论：综上所述，双启动子shRNA载体转染卵泡的颗粒细胞后，可显著降低INHA基因mRNA与蛋白的表达，相比单个靶特异性序列的单启动子shRNA载体有更高的抑制效率。