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第一部分 新型椎间盘髓核标志物在退变髓核中的表达和评估目的：评估包括碳酸酐酶12(CA12)在内的新髓核标志物在腰椎退行性疾病病人髓核组织中的标志作用。方法：我们从脊柱手术病人中收集了81例髓核标本,分成退变组和对照组。每个标本都以腰椎磁共振、HE染色和番红O染色评估退变程度,并以qPCR检测aggrecan、Ⅱ型胶原和SOX9的表达水平。所有标本均以qPCR方法检测CA12及其他12个新椎间盘髓核标记物的表达水平。以免疫组织化学和Western Blot检测组织中CA12的表达水平。结果：在退变组中,CA12及其他11个新髓核标记物表达显著低于对照组,且为椎间盘退变的危险因素,以CA12等单因素分析的B值最小。此外,CA12在蛋白水平上也有显著差异表达。结论：CA12等12个新髓核标记物在退变髓核中有差异表达,可以作为髓核退变标记物。第二部分 CA12在椎间盘退变中的作用及其调控机制目的：阐明CA12在椎间盘髓核代谢中的作用及其上游调控机制。方法：为探索CA12在髓核细胞中的具体功能,我们以CA12 siRNA处理大鼠髓核细胞,并检测合成代谢和分解代谢相关指标,同时,我们在CA12 siRNA处理并上调pH时检测合成代谢和分解代谢相关指标。我们以实时定量PCR检测了81例人退变或正常髓核标本中的缺氧诱导因子1α (HIF-1α)和HIF-2α的表达。我们在低氧条件下培养大鼠髓核细胞,并检测低氧诱导CA12的表达。为验证脯氨酸脱氢酶(PHD)/HIF-1对CA12表达的调控,我们以HIF-1α siRNA和PHD抑制剂DMOG处理大鼠髓核细胞,并检测CA12表达水平。结果：在低氧环境下,CA12表达可以增加约30倍。HIF-1α,而不是HIF-2α的表达水平也在退变髓核中下降,并与CA12表达成正相关。HIF-1α水平敲低能够导致CA12水平下降,而DMOG处理后CA12的表达水平升高。CA12敲低可以显著抑制合成代谢相关分子表达,而分解代谢分子保持不变。而上调pH后Ⅱ型胶原和SOX9也可以上调。结论：CA12的表达受PHD/HIF-1轴调控。CA12可能可以通过调节pH影响髓核合成代谢,在椎间盘退行性疾病中起重要作用。第三部分器官培养模型中验证PHD/HIF-1/CA12对椎间盘退变的作用目的：进一步验证PHD/HIF-1对CA12的调控作用及对椎间盘退变的作用。方法：建立全椎间盘培养模型,以DMOG和/或碳酸酐酶抑制剂ACTZ处理全椎间盘培养模型,以HE染色和番红O染色从组织学水平验证退变程度,以qPCR检测aggrecam、Ⅱ型胶原、Ⅰ型胶原、SOX9、CA12和HIF-1α的mRNA水平的表达,以Western Blot检测CA12和HIF-1α蛋白水平的表达。结果：与对照组比较,DMOG处理组的髓核基质明显增多,aggrecan、Ⅱ型胶原和SOX9的表达也显著增多,而DMOG+ACTZ处理组的髓核基质又较DMOG组减少,aggrecan、Ⅱ型胶原和SOX9的表达也有一定程度的回落。另外,DMOG处理后,CA12和HIF-1α在蛋白水平和mRNA水平的表达显著增加,而增加ACTZ处理后,未见明显差异。结论：在全椎间盘器官培养模型中,抑制PHD活性能促进髓核合成代谢,而抑制碳酸酐酶的功能可以一定程度减弱这种促进作用,提示PHD/HIF-1/CA12通路至少在髓核基质合成代谢中起一定作用。