研究目的:研究运脾开胃方对厌食症大鼠血清、胃窦、空肠部Ghrelin、VIP水平及其下游信号蛋白的表达影响,明确运脾开胃方对Ghrelin、VIP信号通路的干预作用;探究运脾开胃方中存在的化学成分,明确其在治疗厌食症质量方面的物质基础。研究方法:1.用特制饲料建立厌食症的大鼠模型,使用运脾开胃方治疗,观察大鼠的食欲、体重变化观察情况。2.检测大鼠血清、胃肠道中VIP、Ghrelin水平;检测胃肠道中VIP、Ghrelin受体及其下游信号蛋白的表达及磷酸化水平。3.用运脾开胃含药血清刺激HGSMC,观测细胞内Ca2+水平的变化情况,检测细胞内IP3R、PKC、MLC及其磷酸化水平。4.运用高效液相色谱-质谱联用技术分析运脾开胃方的单体化学成分。5.用Ghrelin受体抑制剂阻断人胃窦平滑肌细胞HGSMC上的GHSR,用取得的化学成分刺激HGSMC,观测细胞内Ca2+、MLC及其磷酸化水平变化情况。6.选择对HGSMC内Ga2+有干预作用的化学单体成分给小鼠口服灌胃,同时予以Ghrelin受体抑制剂阻断小鼠体内的GHSR,检测小鼠胃排空的变化情况及小鼠胃部MLC及其磷酸化水平的变化。结果:1.经特制饲料喂养8周后,各组雌、雄大鼠进食量、体重均出现显著下降,出现显著厌食症症状(P<0.05或0.01)。经运脾开胃方治疗4-6周后,低、中剂量组大鼠进食量明显升高和模型组、自然恢复组出现显著统计学差异(P<0.05或0.01),但高剂量组和模型组、自然恢复组相比未见统计学差异(P>0.05)。给药6周后,低、中、高剂量雄性大鼠体重和模型组、自然恢复组相比出现显著统计学差异(P<0.05或0.01)。但雌性大鼠的体重只有低、中剂量组和模型组、自然恢复组相比出现统计学差异(P<0.05或0.01),高剂量组只和自然恢复组出现统计学差异(P>0.05)。2.运脾开胃方可以显著提高厌食症大鼠血清中Ghrelin水平,以中剂量组最为明显,和空白组、模型组、自然恢复组相比均有显著统计学差异(P<0.01),其次为低剂量组。经运脾开胃方干预后,低、中剂量组大鼠胃窦部Ghrelin水平显著升高并具有显著统计学意义(P<0.01),而高剂量组大鼠胃窦部Ghrelin水平只和模型组相比有明显上升(P<0.05)。和空白组、模型组相比,运脾开胃高剂量组空肠Ghrelin水平明显上升具有统计学差异(P<0.05或0.01),低、中剂量组只和模型组相比具有统计学差异(P<0.05)。和空白组、模型组、自然恢复组相比,经各剂量的运脾开胃方干预后大鼠胃窦部GHSR水平未见明显变化(P>0.05);运脾开胃低、高剂量组大鼠胃窦部p-IP3R出现显著升高,和空白组、模型组、自然恢复组相比均有显著统计学差异(P<0.01);低、中、高组大鼠胃窦部P-PKC水平较模型组、自然恢复相比均出现显著升高(P<0.01);经运脾开胃方干预后,只有中剂量组大鼠胃窦部的p-MLC水平出现了显著的上调,和空白组、模型组、自然恢复组相比均有统计学差异(P<0.01)。经低、中剂量的运脾开胃方干预后,厌食症大鼠空肠部GHSR未见明显变化(P>0.05);经运脾开胃方干预后,低、中剂量组大鼠空肠部p-IP3R较模型组、空白组出现显著升高趋势(P<0.01),但是自然恢复组p-IP3R水平较模型组也同样出现显著的上调趋势(P<0.01);经运脾开胃方各剂量干预后,低、中、高组大鼠胃窦部p-PKC水平较模型组、自然恢复相比均出现显著升高的趋势(P<0.01);和其他各组相比,模型组p-MLC表达明显降低,且具有不同程度的统计学差异(P<0.01或P<0.05)。3.经各剂量运脾开胃方治疗后,低、中、高剂量组厌食症大鼠的VIP水平出现一定程度的上升,但是只有高剂量组的VIP水平出现明显的上调,和空白组、模型组、自然恢复组相比出现统计学差异(P<0.05)。低、中、高剂量组和空白组大鼠胃窦、空肠部VIP水虽出现了一定程度的升高,但是没有统计学差异(P>0.05)。经运脾开胃方低、中、高剂量组干预后厌食症大鼠胃窦部VPAC2水平显著升高(P<0.01);低、中、高剂量组大鼠胃窦部p-PKA均出现了显著的上调趋势,但是和空白组相比只有高剂量组体现出了显著提高趋势(P<0.01);和模型组、自然恢复组相比,经运脾开胃方干预后低、中剂量组厌食症大鼠胃窦部p-eNOS水平明显升高,且具有显著统计学意义(P<0.01),而低剂量组p-eNOS表达水平却未见明显变化(P>0.05)。和模型组、自然恢复组相比,经运脾开胃方低、中、高剂量组干预后厌食症大鼠胃窦部VPAC2水平显著升高(P<0.01);和模型组、自然恢复组相比,经运脾开胃方干预后,低、中、高剂量组大鼠胃窦部p-PKA均出现了显著的上调趋势(P<0.05或0.01),但是和空白组相比却体现出了显著下降趋势(P<0.01)。和模型组、自然恢复组相比,经运脾开胃方干预后只有低剂量组厌食症大鼠胃窦部p-eNOS水平明显升高,且具有显著统计学意义(P<0.05或0.01)。4.运脾开胃含药血清中、高剂量组能在10-40s时间段内显著提升HGSMCs内的Ca2+荧光强度(P<0.01),低剂量组运脾开胃含药血清刺激HGSMCs20s后相对荧光强度开始出现显著统计学差异(P<0.01),持续20s。运脾开胃含药血清刺激10、20 min后可以显著上调p-IP3R水平且具有明显的量效依赖关系;运脾开胃各剂量组含药血清刺激HGSMCs 1Omin后,可见HGSMCs内p-PKC、p-MLC水平显著上升(P<0.01或0.05)且具有明显的量效依赖关系,其余时段运脾开胃各组p-PKC、p-MLC水平虽然也有一定程度的上升,但是上调的程度不及1Omin。(D-Lys3)-GHRP-6能显著抑制运脾开胃含药血清对p-IP3R、p-PKC、p-MLC的上调作用且具有显著统计学意义(P<0.01);D-HBSS和Thapsigargin能显著抑制运脾开胃含药血清对p-IP3R、p-MLC的上调作用(P<0.01),但是却不能抑制运脾开胃含药血清对p-PKC的上调作用。5.UPLC-LTQ-Qrbitrap色谱图和质谱结果显示,运脾开胃方中存在芦丁、牡荆素、柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素、桔皮素、苍术素、绿原酸、金丝桃苷、木犀草素、芹菜素、槲皮素12个化学单体成分,分别来自于陈皮、山楂和苍术,未发现来源于鸡内金的成分。6.在运脾开胃12个化学单体成分中,只有柚皮苷、苍术素引起的Ca2+内流能被(D-Lys3)-GHRP-6所阻断。苍术素在10min左右可以显著提高p-MLC水平,同时具有明显的量效依赖关系(P<0.01)。(D-Lys3)-GHRP-6、D-HBSS 和 Thapsigargin 均能抑制苍术素对HGSMCs内p-MLC的上调作用。苍术素可以显著提高昆明小鼠的胃排空率,但是只有苍术素中、高剂量组的升高具有统计学意义(P<0.05或0.01),而低、中、高剂量的苍术素还能上调小鼠胃窦部的p-MLC水平(P<0.05或0.01);在使用(D-Lys3)-GHRP-6对小鼠腹腔进行注射后,苍术素对小鼠的促胃排空和上调胃窦部p-MLC水平的能力均被明显抑制(P<0.01)。结论:1.运脾开胃方可以显著改善成年厌食症大鼠进食减少和体重减轻的症状,对大鼠厌食症有着非常显著的疗效。2.低、中、高剂量的运脾开胃方可以显著上调厌食症大鼠血清和胃窦部Ghrelin的水平,对大鼠胃窦、空肠部的p-IP3R、p-PKC、p-MLC有不同程度的上调的作用,对厌食症大鼠的胃肠运动有显著的促进作用。3.运脾开胃方各剂量组能不同程度上调厌食症大鼠胃窦、空肠部VIP下游p-PKA、p-eNOS水平,促进胃肠道平滑肌的容受性舒张,其机制可能和上调VIP受体VPAC2有关。4.运脾开胃含药血清能显著上调HGSMCs中p-IP3R、p-PKC、p-MLC水平,其机制与促进细胞内Ca2+释放和激活Ghrelin受体GHSR有关。5.UPLC-LTQ-Qrbitrap技术显示运脾开胃方的水提物中存在芦丁、牡荆素、柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素、桔皮素、苍术素、绿原酸、金丝桃苷、橙皮苷、木犀草素、芹菜素、槲皮素这12个化学单体成分,可能为运脾开胃方的物质基础。.6.在运脾开胃方12个化学单体成分中,苍术素可以激活HGSMCs表面的GHSR,促进Ca2+内流进而上调细胞内p-MLC水平,同时经由GHSR促进小鼠胃排空上调胃窦部p-MLC水平,是运脾开胃方激活Ghrelin信号通路的物质基础之一。