商品蛋鸡480日龄后,产蛋量急剧降低,缩短蛋鸡的使用年限,严重影响蛋鸡饲养价值。蛋鸡产蛋量的多少主要取决于蛋鸡卵巢功能高低,以及卵泡的发育状况,而蛋鸡卵泡发育过程中卵黄沉积与肝脏合成卵黄前体物的能力密切相关。大量研究表明,细胞中新陈代谢产生的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)积聚引起的氧化应激是导致器官功能失常的主要原因。大量研究表明,抗氧化物质的补充可缓解ROS对组织和器官的氧化损伤。本实验以海兰褐壳蛋鸡为研究对象,一方面研究了不同产蛋阶段蛋鸡卵黄前体物生成和卵巢抗氧化能力的变化,另一方面通过建立体外诱导卵巢衰老模型和衰老卵巢组织体外培养模型研究葡萄籽原花青素提取物(Grape seed proanthocyanidin extract,GSPE)和番茄红素(Lycopene)对蛋鸡衰老过程中卵巢氧化应激的缓解作用,为延缓蛋鸡卵巢衰退,延长蛋鸡使用年限和提高蛋鸡产蛋量提供理论依据。1.不同产蛋阶段蛋鸡卵黄前体物生成的变化本研究通过比较 90(D90)、150(D150)、280(D280)和 580(D580)日龄蛋鸡血清雌激素的水平、肝脏雌激素受体基因和卵黄前体物生成相关基因表达量,“肝脏-血液-卵巢轴”中甘油三酯(triglyceride,TG)和总胆固醇的含量和肝脏抗氧化能力的动态变化,揭示蛋鸡卵黄前体物生成随着年龄增长的变化规律。结果显示:蛋鸡由D90生长至D150,血清雌二醇(17β-estradiol,E2)水平和肝脏组织中TG含量大幅度升高,但在D580急剧降低。与血清E2水平变化一致,D580蛋鸡肝脏组织雌激素受体(Estrogen receptor α,ERα)和的表达量显著降低,同时,D580蛋鸡肝脏组织中脂肪酸合成相关基因的转录水平显著下调。此外,肝脏组织中D580蛋鸡肝脏组织中抗氧化物质含量显著下降而丙二醛(Malonaldehyde,MDA)水平显著高于其它阶段。以上结果表明,在蛋鸡衰老过程中,血清E2水平、肝脏ERα、ERβ和卵黄前体物质合成相关基因表达量降低,肝脏抗氧化能力降低,引起肝脏合成TG的能力下降,最终导致卵黄前体物质合成能力降低。2.不同产蛋阶段蛋鸡卵巢组织抗氧化能力的变化本研究通过比较不同产蛋阶段(D90、D150、D280和D580)蛋鸡卵巢组织中还原性谷胱甘肽(Glutathione,GSH)含量、总抗氧化能力(Total antioxidant capacity,T-AOC)、抗氧化酶类活性、氧化产物的水平以及抗氧化相关信号通路Nrf2/HO-1相关蛋白和基因表达水平的变化,揭示蛋鸡卵巢组织抗氧化能力随年龄增长的变化规律。结果显示:伴随着蛋鸡产蛋性能的下降,D580蛋鸡卵巢组织中GSH含量、T-AOC和总超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽-S-转移酶显著降低,而MDA、过氧化氢和ROS水平显著升高,同时,D580蛋鸡卵巢组织抗氧化基因的表达水平显著降低。此外,在蛋鸡衰老过程中,与组织抗氧化能力密切相关的卵巢组织核转录因子NF-E2相关因子(Nuclear factor(erythroid-derived2)-like2,Nrf2)和血氧合酶 1(Hemooxygenase,HO-1)表达水平显著降低,Nrf2/HO-1通路下游相关基因的转录水平显著下调。以上研究结果表明在蛋鸡衰老过程中,卵巢组织中抗氧化物质含量下降、抗氧化酶类活性降低、氧化产物逐渐积累伴随着关键抗氧化通路Nrf2/HO-1活性降低,导致蛋鸡卵巢组织抗氧化能力下降,氧化应激加剧。3.葡萄籽原花青素提取物通过抑制氧化应激延缓蛋鸡卵巢衰老氧化应激是引起雌性动物卵巢功能下降的主要因素之一。本研究主要通过建立体外D-半乳糖(D-galactose,D-gal)诱导衰老模型探究GSPE对蛋鸡卵巢衰退的缓解作用。在体外使用D-gal(2.5mg/mL)处理D90蛋鸡卵巢组织,建立体外诱导衰老卵巢模型,同时添加GSPE处理(5μg/mL)后,检测各组卵巢组织抗氧化能力、细胞增殖和细胞凋亡。随后,在体外培养的D280和D580蛋鸡卵巢组织中,单独添加GSPE处理(5 μg/mL),检测处理后卵巢组织抗氧化能力、细胞增殖和凋亡的变化。结果显示:GSPE通过提高卵巢组织抗氧化酶的活性、上调抗氧化基因的转录水平缓解D-gal诱导衰老和自然衰老卵巢组织的氧化应激。同时GSPE可以促进D-gal诱导衰老和自然衰老卵巢组织中细胞增殖并抑制细胞凋亡,减轻卵巢组织所受的氧化损伤。此外,GSPE显著改善D-gal诱导衰老卵巢组织颗粒细胞细胞核染色质固缩现象。以上研究结果表明,GSPE通过缓解卵巢组织氧化应激延缓蛋鸡卵巢衰退。4.番茄红素通过激活Nrf2/HO-1通路缓解衰老蛋鸡卵巢的氧化应激番茄红素是具有极强抗氧化特性的类胡萝卜素,本实验旨在研究番茄红素对蛋鸡卵巢衰退的缓解作用,以及可能的分子机制。首先通过D-gal诱导衰老卵巢模型探究番茄红素对衰老卵巢抗氧化能力、细胞增殖和凋亡的作用。然后检测番茄红素对D-gal诱导衰老卵巢组织Nrf2/HO-1信号通路相关蛋白和基因表达水平的影响,以及在加入Nrf2激活剂和阻断剂后,番茄红素对D-gal诱导衰老卵巢氧化应激缓解作用的变化,确定番茄红素对D-gal诱导衰老卵巢组织氧化应激的缓解作用是否依赖Nrf2/HO-1信号通路。最后,通过体外培养D280和D580蛋鸡卵巢组织中添加番茄红素处理,验证番茄红素是否具有缓解自然衰老蛋鸡卵巢组织氧化应激的作用。结果显示番茄红素通过提高卵巢组织抗氧化酶类的活性、上调Nrf2/HO-1信号通路相关蛋白和基因的表达水平,缓解D-gal诱导衰老和自然衰老卵巢组织的氧化应激。番茄红素对D-gal诱导衰老卵巢组织的保护作用被Nrf2阻断剂消除。同时番茄红素促进衰老卵巢细胞增殖,抑制细胞凋亡。此外,番茄红素显著改善D-gal诱导衰老卵巢组织颗粒细胞线粒体损伤。以上研究表明,番茄红素通过激活Nrf2/HO-1信号通路缓解衰老蛋鸡卵巢组织的氧化应激。综上所述,本研究的结果表明,在蛋鸡衰老过程中雌激素作用衰退以及肝脏抗氧化能力降低致使肝脏中卵黄前体物合成下降;同时,卵巢组织中抗氧化能力降低,卵巢氧化应激加剧,最终导致卵巢衰退;通过体外添加D-gal培养蛋鸡卵巢组织,建立体外诱导衰老卵巢模型,在此基础上探索GSPE和番茄红素延缓卵巢衰退的作用。这些结果为延缓蛋鸡卵巢衰退,提高蛋鸡产蛋量提供理论基础。