第一部分慢性鼻-鼻莫炎上皮细胞中Brg1及β-catenin的表达研究研究背景:慢性鼻-鼻窦炎(chronic rhinosinusitis,CRS)是耳鼻咽喉头颈外科的常见病,鼻黏膜发生慢性炎症改变,其发生发展是一个复杂的炎性过程。根据欧洲EPOS指南,被分为两类,分别是:伴有鼻息肉的慢性鼻-鼻窦炎(chronic rhinosinusitis with nasal polyps,CRSwNP)和不伴鼻息肉的慢性鼻-鼻窦炎(chronic rhinosinusitis without nasal polyps,CRSsNP)。鼻-鼻窦黏膜中,完整的黏液纤毛系统,联合上皮细胞和中性粒细胞组成机械屏障,其中的上皮细胞还是先天性免疫的重要组成部分,更是机体对外界刺激的第一道防线。研究发现,大多数的CRSwNP患者的上皮出现结构和功能的异常,其主要的组织学特征就是黏膜的慢性炎症以及上皮组织异常重塑。鼻黏膜上皮细胞(nasal epithelial cells,NEpCs)具有屏障功能,严密调控着黏膜上皮的密闭性和渗透性,是呼吸道对抗外界刺激的重要屏障。完整的鼻黏膜上皮有效的阻止了病原体及有害物质对上皮下组织的侵害,还可通过调节其对炎性细胞的透过性而参与炎性反应。鼻黏膜上皮的完整性遭到破坏,会导致大量病菌进入黏膜下组织,引起鼻腔及鼻窦黏膜的炎性改变。慢性鼻-鼻窦炎典型的病理特征就是鼻上皮屏障的破坏与组织重塑。Brg1是哺乳动物中染色质重组复合物BAF(Brg1/Brm associated factor)的核心水解酶亚基,在哺乳动物的胚胎发育以及出生后的成长过程中发挥着极其重要的作用。Brg1通过ATP酶水解产能,能够通过与不同的启动子特异性结合来激活或者抑制上千种基因的表达,通过调控转录影响着细胞的增殖与分化、DNA修复、细胞粘附以及细胞周期控制等。基于已经证实的Brg1在上皮细胞的增殖和分化、肿瘤发生、神经元发育成熟、心脏发育和内耳发育中具有的重要作用,我们因此推测,CRS中的Brg1可能导致NEpCs的异常增殖和分化,参与了 CRS的上皮重塑进程。β-catenin属连环蛋白家族成员。在细胞内,主要通过结合特异的相关蛋白来调节细胞的生理活动,其中被广泛研究的主要是两个功能,一是作为经典Wnt信号通路的信号转导因子来协同调控T/LEF基因。二是结合钙粘素家族(Cadherin)参与细胞之间的粘附,在维持上皮屏障完整性中发挥着重要作用。研究发现β-catenin在细胞膜、浆、核的分布和空间位点的变化决定了其功能和效应的变化:当β-catenin与Cadherin形成复合体定位于细胞膜,发挥细胞间黏附功能时,它能够维持细胞的稳定性。若β-catenin自复合体解离,游离于胞浆时,β-catenin会在胞浆中逐渐积累,并且进入细胞核,活化Wnt/β-catenin通路,启动下游靶基因c-myc,cyclinDl等的转录,从而促进调节细胞的分化与增殖。由此可见β-catenin的膜-核转位状态决定了上皮细胞的稳定和增殖状态的转换。研究发现:Brg1可以通过直接调节β-catenin,从而影响Wnt信号通路:在正常情况下,Brg1能够与β-catenin结合,从而增强β-catenin-TCF复合物对目的基因的转录活性,维护细胞正常的稳定和分化。而在Brg1下调后,失去了ATP酶活性的Brg1则对Wnt信号通路表现出显性突变抑制的作用,随后介导了细胞的异常增殖和分化,破坏了生物体正常的发育过程。这些研究提示我们:Brg1与β-catenin在参与细胞增殖和分化精细调控方面,对Wnt信号通路具有相似的影响。综上所述,我们推测Brg1通过调控β-catenin而影响wnt信号,参与了 NEpCs的增殖与分化。因此,我们从Brg1调控NEpCs的增殖和分化这一关键点出发,用药物刺激人鼻黏膜上皮细胞(human nasal epithelial cells,HNEpCs)来模拟CRS的鼻黏膜上皮炎性状态,同时应用免疫荧光、Western等技术对鼻息肉组织和正常的下鼻甲黏膜组织进行一系列检测,来达到以下研究目的:①明确CRS的NEpCs中Brg1和β-catenin的表达变化及与NEpCs异常增殖和分化的相关性。②明确Brg1和β-catenin表达的改变对NEpCs增殖和分化的影响,阐明Brg1调控鼻黏膜上皮细胞参与CRS发病的机制。本研究结果将有助于更深入地阐明CRS上皮重塑的机制,为CRS的防治提供新的分子靶标和思路。研究方法:1.组织实验:我们将20名伴有鼻息肉的慢性鼻-鼻窦炎(CRSwNP)的患者作为实验组,14名患有鼻中隔偏曲且不伴有其他鼻部疾病的患者作为正常对照组。行鼻内窥镜手术的同时,留取CRSwNP患者的鼻息肉组织,以及单纯行鼻内窥镜下鼻中隔偏曲矫正术患者的下鼻甲黏膜组织作为标本。之后提取鼻息肉组织及下鼻甲黏膜中的总RNA和蛋白质,利用RT-PCR和Westerm blot等技术检测两类标本中Brg1和β-catenin的表达水平,并通过免疫组化和免疫荧光方法观察两类鼻黏膜上皮Brg1和β-catenin的表达模式和表达定位。2.细胞实验:购买并培养人鼻黏膜上皮细胞(HNEpCs)。用浓度为2.5μl/ml的TNF-α刺激HNEpCs来模拟CRS鼻黏膜上皮细胞的慢性炎症状态,并分别于TNF-α刺激后0h,6h,12h,24h,48h和72h检测细胞内的Brg1和β-catenin的表达水平,利用免疫荧光和免疫组织化学方法等检测Brg1和β-catenin在正常的HNEpCs上的定位,以及被TNF-cα刺激后Brg1和β-catenin在HNEpCs上的表达模式和表达定位。研究结果:1.在我们的研究中,Brg 1和β-catenin在CRSwNP的鼻息肉组织及对照组的下鼻甲黏膜组织中均有表达,且主要定位于鼻黏膜上皮细胞。CRSwNP患者的鼻黏膜中Brg1和β-catenin的表达水平较对照组中的Brg1和β-catenin的表达水平显著降低。在正常对照组,β-catenin大部分在细胞膜表达,在CRSwNP组,β-catenin转移到核内。但是Brg 1在CRSwNP和正常对照组的定位表达没有明显的差异,均在细胞质和细胞核表达。2.在对HNEpCs的研究显示:用TNF-α刺激HNEpCs,随着药物刺激细胞的时间延长,Brg1和β-catenin的表达呈逐渐下降趋势,从药物刺激后24h开始,下降趋势开始变得明显。Brg1和β-catenin表达模式的变化具体表现在:随着TNF-α刺激时间的延长,β-catenin从细胞膜定位转变为核定位,Brg1从细胞核部分转移到细胞质,这与我们之前观察到的组织染色结果相似。研究结论及意义:本研究表明:Brg1和β-catenin在鼻黏膜上皮细胞均有表达,均定位于鼻黏膜上皮层。来源于CRSwNP的鼻黏膜上皮细胞的生长和增殖能力较正常对照组出现明显下降。与正常对照组比较,Brg1和β-catenin的表达在异常增生的鼻息肉组织中出现明显的下降和细胞转位,这也在我们用TNF-cα刺激模拟炎症状态的HNEpCs中进一步得到证实。生长和增殖性能的这种本质上的不同可能是鼻息肉持续和异常重塑的起因。第二部分细菌溶解产物OM-85 BV对慢性鼻-鼻窦炎小鼠治疗作用的研究研究背景:慢性鼻-鼻窦炎(chronic rhinosinusitis,CRS)一直被认为是一个重要的公共健康问题,根据国际及国内诊疗指南,CRS经常被分为伴有鼻息肉的慢性鼻-鼻窦炎(chronic rhinosinusitis with nasal polys CRSwNP)和不伴有鼻息肉的慢性鼻-鼻窦炎(chronic rhinosinusitis without nasal polys,CRSsNP)。引起CRS的病原菌多样化,有需氧菌,厌氧菌,真菌,病毒等,临床表现复杂且具有多样性,多伴有鼻塞、流涕,头痛和嗅觉障碍等症状。CRS患者的鼻黏膜受损严重,并呈持续的炎症状态,治疗周期长,易反复。伴有鼻息肉的CRS的综合治疗效果更差,术后易复发,许多患有CRS的患者深受其困扰,严重者甚至可以引起心理方面的疾病。OM-85 BV是提取自8种革兰氏阳性和阴性细菌的冻干溶解物,这些细菌均与呼吸道密切相关,包括:流感嗜血杆菌、化脓性链球菌、肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷白菌、卡他奈瑟菌、草绿色链球菌、臭鼻克雷白菌。OM-85 BV主要由多肽类、氨基酸以及酸性蛋白质组成。OM-85 BV对人体是一种非病原性细菌产物,它具有免疫活性,并作为免疫刺激剂来增强免疫细胞的活性且促进免疫因子的产生。OM-85 BV已被广泛用于治疗成人和儿童哮喘,慢阻肺及反复发生的呼吸道感染等呼吸道疾病,但其对于CRS的作用研究甚少。鼻腔和气管、支气管共同构成呼吸道,从组织来源和组成来看,鼻腔和呼吸道具有相同的胚胎组织来源,其发病和治疗有着相似性,本实验通过对CRS的小鼠模型服用OM-85 BV,来探讨OM-85 BV对CRS的治疗作用。研究方法:1.8-12周龄的雌性BALB/c小鼠40只,随机分为4组,每组10只。其中1组小鼠(A组)作为正常对照组,不对其使用任何药物刺激。其余3组小鼠(B、C、D组)使用烟曲霉菌提取物(AF)对小鼠进行腹腔注射,1周后使用AF对小鼠进行滴鼻,每周3次,持续12周,以此建立CRS模型。2.造模成功后的3组小鼠顺序被打乱,随机分为3组,每组10只,作为患有CRS的小鼠参与实验。最后40只小鼠被分为4组:A组,正常对照组。B组,CRS模型组。C组,OM-85 BV联合阿莫西林治疗CRS组。D组,单独使用阿莫西林治疗CRS组。3.A组和B组以无菌水代替药物进行治疗,C组给予口服OM-85 BV加阿莫西林,服用10天后停服20天,1个月为一个疗程,治疗3个疗程。D组给予单独口服阿莫西林,用药频率和时间同C组。4.将小鼠的鼻窦黏膜取出,通过HE染色来观察患有CRS的小鼠鼻窦黏膜的组织学改变。提取小鼠鼻窦黏膜的RNA和总蛋白,利用蛋白质免疫印迹法(WB)和RT-PCR技术来分别测定细胞因子信号抑制物(SOCS1,SOCS3),肿瘤坏死因子(TNF-α)和干扰素(IFN-γ)在小鼠鼻窦黏膜的表达。研究结果:1.与正常对照组小鼠相比较,CRS模型组小鼠的鼻黏膜上皮基底膜组织明显增厚,纤毛上皮组织中出现纤毛排列紊乱,缺失。2.单独使用阿莫西林治疗组与OM-85 BV与阿莫西林联合治疗组,和未行治疗的CRS模型组小鼠相比较,SOCS1,SOCS3,TNF-α,IFN-γ的蛋白和mRNA 表达均出现明显的降低(0.807 vs 0.214/0.367。0.787 vs 0.345/0.428。0.841 vs 0.320/0.456。0.769 vs 0.402/0.487)。3.与正常对照组相比,OM-85 BV与阿莫西林联合治疗组的SOCS1,SOCS3,TNF-α,IFN-γ的蛋白表达和mRNA表达无明显统计学差异。4.OM-85 BV与阿莫西林联合治疗组与单纯使用阿莫西林治疗组相比较,其SOCS1,SOCS3,TNF-α,IFN-γ的蛋白表达和mRNA表达均出现明显降低。研究结论及意义:细菌提取产物OM-85 BV和阿莫西林对于CRS均有效。OM-85 BV与阿莫西林联合用药,对于CRS有明显的治疗作用。OM-85 BV具有花费低廉,相对安全,使用方便的优势,可以作为治疗CRS的一种新型药物应用于临床。