荆芥内酯(C10H14O3,Schizonepetin)是从中药荆芥中提取、分离得到的一种单萜类化合物。药效学研究表明,荆芥内酯具有较好的抗流感病毒活性以及明显的解热、镇痛、抗炎、抗过敏等作用,具有很好的研发价值。目前,有关荆芥内酯的研究报道,主要集中在质量标准、提取工艺和药理作用等方面,而对其药代动力学及代谢机制方面的研究则较少。因此,探明药物在生物体内的动态变化规律和可能发生的药物相互作用显得相当重要。本文通过对荆芥内酯在生物体内的药代动力学过程及代谢机制进行系统研究,以期明确其体内的药动学特征,阐明发生药物相互作用的潜力,以便指导临床用药和剂型设计,实现“安全、有效、经济、合理”用药。研究内容主要包括:文献研究、荆芥内酯的水溶性和脂溶性研究、荆芥内酯在大鼠体内的口服绝对生物利用度研究、胃肠吸收动力学研究、组织分布特征研究、排泄研究、代谢产物及生物转化途径研究以及荆芥内酯体内/外对肝药酶体系的影响研究。(一)文献研究查阅国内外相关文献,对目前流感病毒的研究概况、临床前药代动力学的研究方法、药物及其代谢产物的分析方法以及细胞色素CYP450酶的研究概况进行了综述,并对本课题的研究思路与方法作了简要说明。(二)荆芥内酯的溶解性和脂溶性研究建立荆芥内酯的体外含量测定方法,对其溶解性和脂溶性进行考察。结果表明,荆芥内酯在石油醚中几乎不溶,在水中的平衡溶解度较低,在甲醇中的平衡溶解度较高,在强碱性条件下内酯环开裂而使其溶解度增大。荆芥内酯在25℃时的表观正辛醇/水分配系数为49.35 (1gKow=1.69),在酸性至中性磷酸盐缓冲溶液中的表观分配系数变化不大,而碱性条件下的表观分配系数明显下降。在pH7.4、温度37℃条件下,其生物分配胶束色谱容量因子为15.98 (1gKBMC= 1.203),表明荆芥内脂具有较好的亲脂性和人体吸收分数。(三)荆芥内酯的口服绝对生物利用度研究选用SD大鼠,建立大鼠血浆中荆芥内酯的HPLC含量测定方法,考察不同给药途径(i.g.和i.v.)给予不同剂量荆芥内酯后血药浓度的变化,并采用Kinetica 4.4药动学软件计算药动学参数,研究荆芥内酯在大鼠体内的药动学特征和口服绝对生物利用度。结果表明,大鼠不同给药途径给予不同剂量荆芥内酯后,AUC0-t、Cmax与给药剂量呈线性增加,相关系数均大于0.9, MAT (MAT = MRTig- MRTiv)为0.8 h左右,t1/2均在3～4 h左右,灌胃组的Tmax均在0.7 h左右,说明荆芥内酯在大鼠体内吸收迅速,消除较快,且吸收和消除与给药剂量无关,属于线性药物动力学过程。荆芥内酯在大鼠体内的口服绝对生物利用度约为75%。(四)荆芥内酯的大鼠在体胃肠吸收动力学研究1.荆芥内酯的大鼠原位胃吸收研究采用大鼠原位胃灌注模型,以HPLC-UV法测定灌注液中荆芥内酯的浓度。结果显示,不同质量浓度(1.84、3.68、7.36 μg·ml-1)的荆芥内酯在大鼠胃部吸收较好,每小时吸收百分率分别为(19.47±0.69) %、(21.66 ± 1.92) % 和(26.51 ± 1.25) %,推测荆芥内酯在大鼠胃部的吸收方式可能为被动转运。2.荆芥内酯的大鼠在体肠吸收研究采用大鼠在体肠吸收模型,以酚红标记法校正循环液体积,HPLC法测定不同时刻循环液中荆芥内酯的浓度。结果显示,不同质量浓度(1.84、3.68、7.36μg·ML-1)荆芥内酯的吸收速率常数Ka分别为(0.2028 ±0.0070)、(0.1589±0.0114)和(0.1342±0.0122)h-1;质量浓度为3.68 μg·L-1的荆芥内酯在大鼠十二指肠、空肠、回肠的吸收速率常数Ka分别为(0.0238 ±0.0006)、(0.0125 ±0.0005)和(0.0165 ±0.0008) h-1;结扎胆管与否以及肠道菌群的破坏,对荆芥内酯的肠吸收影响不大;加入p-gp糖蛋白抑制剂组与对照组比较,其Ka值之间存在显著性差异。推测荆芥内酯在大鼠肠道的吸收呈一级动力学过程,吸收机制为主动转运,并且在大鼠各个肠段均有吸收,其中十二指肠为其最佳吸收部位。(五)荆芥内酯在大鼠体内的分布特征研究1.荆芥内酯在大鼠体内的组织分布研究建立大鼠各组织样品中荆芥内酯的HPLC含量测定方法,考察大鼠不同给药途径(i.g.和i.v.)给予一定剂量荆芥内酯后不同时间点组织器官中药物浓度的变化,并对组织分布情况进行分析。结果表明,无论是口服途径给药还是静脉给药,荆芥内酯在大鼠体内吸收迅速,广泛分布于各组织器官,靶向性不明显,无明显蓄积作用。2.荆芥内酯在大鼠血浆中的蛋白结合率研究建立大鼠血浆和透析外液中荆芥内酯的HPLC含量测定方法,采用平衡透析法测定荆芥内酯的血浆蛋白结合率。结果表明,37℃C条件下,低、中、高(0.08、0.63、6.30μg·mL-1)质量浓度的荆芥内酯在大鼠血浆中的蛋白结合率分别为(62.23 ± 1.25)%、(62.71 ±0.04)%、(63.99±0.79) %。说明荆芥内酯具有中等强度的蛋白结合率,且蛋白结合率与透析液的药物浓度无关。(六)荆芥内酯在大鼠体内的排泄研究建立液-液萃取后HPLC测定大鼠尿液、粪便和胆汁中荆芥内酯含量的方法,并对大鼠经不同给药途径(i.g.和i.v.)给予一定剂量荆芥内酯后的排泄情况和排泄特点进行分析。结果显示,大鼠灌胃荆芥内酯(24mg·kg-1)后,胆汁12h内、尿液36h内的排泄具有明显的雌雄差异(P<0.05),粪便36h内的雌雄差异不明显(P>0.05);静脉注射荆芥内酯(12mg·kg-1)后,尿液36h内的排泄具有明显的雌雄差异(P<0.05),粪便36h内的差异不明显(P>0.05)。说明荆芥内酯在大鼠尿液和胆汁中的排泄具有明显的雌雄差异,以原型形式随尿液、粪便和胆汁排泄的量很少,可能主要以代谢产物的形式排出体外。(七)荆芥内酯代谢产物的分离鉴定与活性评价研究收集大鼠灌胃给予荆芥内酯后的尿液,初步处理以后,采用大孔吸附树脂去除水溶性杂质,以40%乙醇洗脱,洗脱液回收溶剂后通过硅胶柱层析、SephadexLH-20柱层析和重结晶等方法,分离得到相关代谢产物,并将各代谢产物进行抗病毒活性筛选。结果显示,荆芥内酯各代谢产物在体外对流感病毒H3N2和疱疹病毒HSV-1均没有表现出明显的抗病毒活性,推测荆芥内酯抗病毒活性可能主要是以原型药发挥作用。(八)荆芥内酯对细胞色素CYP450活性的影响1.荆芥内酯体外对大鼠肝微粒体CYP450酶的影响采用CaCl2沉淀法制备大鼠肝微粒体,考察荆芥内酯对大鼠肝微粒体CYP450酶的影响。采用考马斯亮蓝法测得所制备的肝微粒体蛋白含量约为10.02 mg·mL-1;以奥美拉唑孵育证明所采用的肝微粒体孵育系统可用。结果显示,荆芥内酯在大鼠肝微粒体中几乎不产生代谢转化,说明口服荆芥内酯,几乎无首过代谢作用。另外,荆芥内酯对各种CYP450酶的经典底物的代谢没有明显的抑制作用,这表明荆芥内酯在CYP介导的代谢水平上的相对安全性。2.荆芥内酯对大鼠CYP450酶经典底物药动学参数的影响分别以非那西丁、氨苯砜、氯唑沙宗、奥美拉唑和美托洛尔作为CYP1A2、CYP3A1/A2、CYP2E1、CYP2C19及CYP2D6的探针底物,每日以24 mg·kg-1剂量灌胃给予荆芥内酯,连续给药7 d。采用HPLC法测定连续给予荆芥内酯前后大鼠血浆中相应探针底物的浓度及其药动学参数。结果显示,连续灌胃给予荆芥内酯7d后,对CYP3A1/3A2酶活性有明显的诱导作用,对CYP1A2、CYP2E1及CYP2D6则表现出明显的抑制作用,而对CYP2C19酶活性无影响。3.荆芥内酯对大鼠CYP450同工酶基因mRNA表达的影响采用real-time RT-PCR法定量分析了荆芥内酯对大鼠肝脏CYP450酶亚型CYP3A1、CYP1A2和CYP2E1的mRNA表达水平的影响。结果显示,荆芥内酯低剂量组3A1、1A2和2E1的相对mRNA含量与空白组相比,差异无显著性意义;中、高剂量组荆芥内酯在mRNA的表达水平上对3A1、1A2和2E1均有一定的诱导作用(P<0.05),并且高剂量时可诱导肝药酶加速自身代谢。综上所述,可知荆芥内酯的水溶性较差,脂溶性较好,在胃肠道有较好吸收,其中胃部吸收机制为被动转运,小肠为主动转运,在大鼠体内的口服绝对生物利用度为75%,组织分布广泛,无明显的靶器官,以原型形式排泄的量较少,相关代谢产物无明显抗病毒活性。荆芥内酯在大鼠肝微粒体中几乎不产生代谢转化,在体内/外对各种CYP450酶经典底物的代谢表现出不同的诱导/抑制作用,联合用药时应综合考虑各种影响因素。