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红曲色素(Monascus pigments)是红曲霉代谢过程中产生的一种重要的天然色素,其具有多种生物活性广泛应用于食品、化妆品、保健品等行业。提高红曲色素产量的同时降低真菌毒素一桔霉素(Citrinin)的含量是红曲色素发酵生产过程中研究者普遍关注的焦点。红曲霉产色素相关基因的研究为构建高产色素低产桔霉素的红曲霉基因工程菌株提供了参考。本文从紫色红曲霉(Monascus purpureus)M-21菌株基因组DNA中克隆获得红曲色素代谢相关基因PigE,并依据同源重组原理成功对Pige基因进行敲除。通过探究PigE基因缺失突变株(△PigE)的生长代谢变化分析了 PigE基因功能,最后对红曲色素的稳定性和抑菌性进行了研究。主要研究结果如下:1、高产色素低产桔霉素红曲霉菌株的筛选与鉴定从全国各地红曲相关制品中分离纯化获得238株红曲霉菌株,分别采用分光光度法和HPLC法检测发酵产物中红曲色素产量和桔霉素含量,最终筛选获得一株红曲色素产量达284.71 U/g,桔霉素含量仅为1.1 mg/L的高产色素低产桔霉素红曲霉菌株M-21,经鉴定为紫色红曲霉(Monascus purpureus)。2、PigE基因的克隆与敲除根据基因序列同源性设计引物,从M.purpureus M-21基因组DNA中扩增获得红曲色色素代谢相关基因PigE,该基因全长1199bp,编码342个氨基酸。基于同源重组原理,以潮霉素抗性基因(hph)作为筛选标记,体外构建PigE基因的敲除载体,并利用根癌农杆菌介导的转化法进行转化,成功获得116株红曲霉转化子。最后,通过hph抗性平板筛选、PCR验证、Southern blot等方法筛选获得一株△PigE突变株。3、△PigE突变株生长代谢分析对△PigE突变株的生长代谢和Pige基因的表达情况进行了分析,研究结果表明:△PigE突变株的菌落形态发生较大改变,而显微结构特征、生长速率无明显改变。PigE基因的缺失主要引起红曲色素的种类和产量的改变。野生型菌株M.purpureus M-21以产生红色素为主,同时产生少量黄色素。△PigE突变株丧失了产生红色素的能力但产生黄色素的种类增多,且其采用红曲米固体发酵13 d后产生的红曲色素色价值达1050 U/g,较野生型M.purpureus M-21菌株提高约1.84倍。△PigE突变株接种于YES液体培养基摇瓶发酵13 d后发酵液中桔霉素含量为1.57 mg/L,其代谢产桔霉素的时间延迟但产量无显著变化。RT-PCR分析结果表明△PigE突变株因PigE基因缺失而无表达。4、红曲色素的稳定性和抑菌性分析提取M.purpureus M-21菌株和△PigE突变株发酵产生的红曲色素分别分析其稳定性和抑菌性。红曲色素稳定性分析表明:在60℃,pH=7~9的环境中,红曲色素的稳定性好。红曲色素对氧化剂NaC104和还原剂Na2S03作用不敏感。与Mg2+、Ca2+、K+、Cu2+相比,红曲色素在Na+溶液中稳定性最好。红曲色素抑菌性分析表明:在4种细菌中,红色素对枯草芽孢杆菌有较弱抑菌性,黄色素对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌皆有较弱的抑菌性。在6种真菌中,红色素和黄色素对黄瓜枯萎病菌、番茄早疫病菌、小麦赤霉病菌、杨树枯萎病菌、草酸青霉均有不同程度的抑菌活性,其中对番茄早疫病菌的抑菌性能最为显著。