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宫颈癌是全球妇女恶性肿瘤中仅次于乳腺癌的第二个最常见的恶性肿瘤。在发展中国家妇女中其发病率居第1位,而在北美及欧洲妇女中其发病远低于乳腺癌、子宫内膜癌及卵巢癌。近几年,在宫颈癌的诊断和治疗上也有许多的进展。目前,外科手术或放化疗可以治愈80-95%的妇女早期疾病(第一和第二阶段)和60%的第三阶段的疾病,但恶性程度较高的肿瘤目前五年生存率仍然较低,目前早发现、早诊断和早治疗,是降低宫颈癌发病率和死亡率的有效途径之一。显而易见,寻找新的分子治疗靶点,更好的理解宫颈癌的发病机理有助于改善宫颈癌病人的预后。从蠕虫到人类,Notch1蛋白在结构和功能上是一种十分保守的跨膜受体蛋白。Notch1基因首先在果蝇中发现,并与神经元细胞命运决定有关,然而,这个受体家族现在已经证实在多种组织的胚胎发育和出生后阶段中调控发育细胞的命运决定。Notch1受体与配体结合后,Notch1发生原位裂解,释放出胞内片段NICD,然后转移至核内。NICD与转录因子Su(H)/CBF1结合,调控靶基因的表达,继而调控细胞的生长和发育。在靶细胞中,组成性表达活化的NICD能够导致激活的“Notch表型”。以前的研究表明Notch1作为一种关键性的信号途径在调控细胞的分化,细胞的发育,增殖以及凋亡中起着十分重要的作用,从而影响许多器官的功能。因而可以设想Notch1功能的失常与各种不同类型的肿瘤的发生密切相关。这种设想已被证实,目前关于Notch1信号途径与肿瘤关系的研究日益增多。Notch1信号途径与人类的几种癌症密切相关,包括肺癌以及成神经细胞瘤。最为明显地是,在T细胞急性淋巴白血病(T-ALL)中,多于50%发现Notch1的激活突变。此外,当Notchl信号被阻断后,在T细胞急性淋巴白血病(T-ALL)中发生细胞静止,表明对Notchl信号的调控是一种治疗肿瘤的有效的方法。另外,现在已经证实,异常的Notchl信号在其它类型的白血病和粘液表皮样瘤中起着十分重要的作用。Notchl作为致癌基因或抑癌基因取决于不同类型的细胞。对Notchl信号途径了解的增多将有助于利用Notchl作为分子靶点治疗癌症。然而,关于Notchl信号途径与宫颈癌相互作用关系的报道尚无定论性的结果。为了更清楚理解Notchl信号途径与宫颈癌发生的关系,本研究首先通过构建真核表达载体,研究Notchl的过表达在宫颈癌中的作用,并通过CCK-8试剂研究过表达Notchl对宫颈癌Hela细胞增殖的影响,进一步通过流式细胞术研究过表达Notchl对宫颈癌Hela细胞周期及凋亡的影响,最后通过Boyden chamber研究其对浸润转移的影响,该研究旨在为以Notchl信号途径为靶点宫颈癌基因治疗的提供理论依据。方法1、从胎盘组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增人Notchl胞内区全长,利用BamHI和XbaI分别对PCR产物和pcDNA3.1(+)进行双酶切。用T4 DNA连接酶分别连接上述回收的片段,连接产物转化感受态大肠杆菌JM109细胞,涂板,过夜培养,挑克隆,提质粒,双酶切鉴定。2、真核表达载体pcDNANICD通过脂质体Lipofectamine2000转染宫颈癌Hela细胞,并利用G418筛选出稳定表达株。3、采用半定量RT-PCR和Western blotting分析转染前后Notchl和Hes1mRNA和蛋白表达的变化。4、采用CCK—8检测试剂盒分析过表达Notchl对细胞增殖的影响。5、利用流式细胞术分析转染前后细胞周期及凋亡的变化。6、Boyden chamber实验计算各组穿膜的细胞数以比较转染Notchl基因对细胞侵袭能力的影响。7、统计学处理：RT-PCR和Western blotting结果均采用Gene Tools软件进行灰度值分析,上述试验均分别重复三次。统计学处理均采用SPSS13.0统计软件,统计学数据用均数±标准差(x±s)表示,行单因素方差分析(one-wayANOVA),P<0.05具显著性。结果1、PCR扩增得到了大约2.3kb的片段,基因大小与预期一致,片段测序后通过Blast比对证明克隆的人Notchl基因序列正确。此外真核表达载体pcDNANICD载体经过BamHI和XbaI双酶切,获得了大约5.4kb和2.3kb的两个片段,表明载体构建正确。2、与未处理和稳定表达pcDNA3.1载体的Hela细胞相比,稳定表达Notchl的Hela细胞中Notch1基因和Hes1基因的mRNA的表达明显增加(P<0.05)。然而,在未处理的和稳定表达pcDNA3.1的细胞中,Hes1基因的表达无差异,但是,Notch1的表达却存在明显的差异(P<0.05),可能是由于脂质体和质粒的毒性所致,也有可能是由于实验操作中的误差。3、与未处理和稳定表达pcDNA3.1载体的Hela细胞相比,稳定表达Notch1的Hela细胞中Notchl和Hesl基因的蛋白的表达明显增加(P<0.05)。然而,在未处理的和稳定表达pcDNA3.1的细胞中,Notch1蛋白的表达无差异,但是,Hes1蛋白的表达却存在明显的差异(P<0.05),可能是由于脂质体和质粒的毒性所致,也有可能是由于实验操作中的误差。4、过表达Notchl能明显地抑制Hela细胞的增殖。5、在未处理的和稳定表达pcDNA3.1的Hela细胞中,细胞周期和细胞凋亡率无差异(P>0.05)。然而,与未处理的和稳定表达pcDNA3.1的Hela细胞相比,过表达Notchl能明显促使细胞周期静止在G0/G1期,并诱导细胞凋亡。6、Boyden chamber体外侵袭实验结果表明,与空白对照组相比,过表达Notchl的Hela细胞穿越Matrigel膜的细胞数显著减少(P<0.05),而未处理的与稳定表达pcDNA3.1的Hela细胞相比,统计学上无差异(P>0.05)。小结1、过表达Notchl能明显抑制Hela细胞的增殖能力,促使其细胞周期静止在G0/G1期。2、Notchl的过表达能抑制Hela细胞的浸润与转移能力并可诱导其凋亡。