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本研究课题构建了一个高效的叶绿体表达载体,使甘蔗丙酮酸磷酸二激酶PPDK能够更好的整合到甜菜的叶绿体中,并且高效表达。以激活甜菜中PEPCase的活性,从而提高甜菜的光合性能,增加甜菜的生物产量。同时为我国的基因工程基础的研究和产业化提供高效的表达载体。本实验利用DNA同源重组技术构建出甜菜叶绿体高效表达载体。本课题以rps7与部分rps12和ndhB片段作为同源片段,首先,利用PCR的方法,从甜菜叶绿体基因组中克隆长度为1.7kb和1.8kb左右的相邻DNA片段,对其进行序列分析表明,克隆的这两条DNA大小分别为1724bp和1740bp,前者包括了rps7、部分rps12基因编码区域以及其边界序列,后者包括ndhB基因的第一个外显子和内含子。然后,从大肠杆菌中克隆了长度为1365bp的pmi基因。利用限制性酶切位点将rps7与部分rps12和ndhB片段转入pBluescript SK+载体中,并将pmi基因作为筛选标记连同其表达框插入两个同源片段之间,构建了甜菜叶绿体的高效表达载体。这个特异性载体将定位整合到甜菜叶绿体基因组中反向重复区的rps7与部分rps12和ndhB基因之间,并高效表达。同时,利用RT-PCR技术克隆出甜菜ppdk基因的cDNA,为研究ppdk基因的cDNA转入甜菜叶绿体基因组后对PEPCase活性的影响作好准备。本实验还构建了6个中间载体和一个高效表达的叶绿体表达载体:1利用限制性限制性酶切位点HindⅢ和EcoRⅠ将CaMV 35S启动子,NOS终止子以及GUS基因由pBI121中切下,连入pUC18中,构建出中间载体pH1。2 pmi基因与其原核表达合连入pUC18构建出中间载体pH2。3利用限制性酶切位点SacⅡ和NotⅠ将rps7与部分rps12基因连入克隆载体pBluescript SK +中,构建出中间载体pLT1。4利用限制性限制性酶切位点KpnⅠ和ApaⅠ将ndhB基因连入载体pTL1中,构建出中间载体pLT2。5中间载体pH3的构建。6 rps7与部分rps12、ndhB与pmi及其表达框连入pBluescript SK+构建出载体pTB。