弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种呈世界性分布且严重危害人类健康的人畜共患寄生虫,一种专性细胞内寄生的原虫。哺乳动物和禽类易受其感染,人类弓形虫感染率也非常高,世界平均感染率约为30%。妊娠早中期的孕妇经胎盘将虫体传染给胎儿,引起流产、死胎或畸形;妊娠晚期感染,胎儿多数表现为隐性感染,于出生数月甚至数年后才逐渐出现症状,如视网膜脉络膜炎、精神运动障碍、脑钙化灶和脑积水等。弓形虫现已被列为感染性致畸(TORCH)综合征主要病原之一。对于免疫缺陷或免疫功能低下者,弓形虫同样是引起致死性疾病的主要病原体之一。此外,弓形虫病也可导致动物流产、弱胎、死胎、生长受阻及死亡,给畜牧业造成巨大的经济损失,因此,弓形虫感染的防治日益受到重视。现有的治疗弓形虫病的药物存在诸多不足,研制和开发一种高效、低毒的抗弓形虫药物迫在眉睫。脂酰辅酶A合成酶(Acyl-CoA synthetase,ACS)是在弓形虫能量和脂类代谢中发挥重要作用的一种Ⅱ类脂肪酸合成酶,在脂类的合成过程中催化反应的关键酶。目前ACS作为药物靶点在隐孢子虫、球虫上面取得了很大的进展,然而在弓形虫的研究中尤其是作为靶点筛选治疗药物方面仍是空白。Triacsin C是一种强效的长链脂酰辅酶A合成酶抑制剂,理论上应该能够干扰弓形虫速殖子脂质的合成,从而抑制其增殖,然而目前未见有相关的报道。转录组学是功能基因组学研究的重要组成部分,是一门研究细胞或组织中基因转录与转录调控规律的学科。它能够分析全部功能基因的表达调节系统,深入全面地了解表达量、调控变化,实现对于遗传信息与机体表型的里外的对应关联,从而从整体上研究生物的调控变化。开展寄生虫转录组研究为其免疫学诊断、新药物靶点的研究以及防治研究奠定基础。因此,本课题通过将不同浓度的Triacsin C在体内作用于弓形虫速殖子,观察其对速殖子的增殖是否具有抑制效果,同时观察不同浓度下药物对实验动物主要脏器的损伤情况,分析弓形虫感染组、感染给药组、给药组以及正常组小鼠肝脏组织的转录组生物信息,探究Triacsin C作为新型抗弓形虫感染药物的可行性。其主要研究结果如下:1.弓形虫荧光定量PCR标准曲线的建立根据GenBank公布的弓形虫529 bp重复序列设计并筛选出特异性小片段引物(qTOX-F、qTOX-R)。本实验制备的质粒标准品所构建的标准曲线为y=-2.857x+37.769,在这连续 6 个点时“108 copies/μL～103 copies/μL”,其值 R2=0.99,检测重复孔的变异系数为0.344%～1.038%。2.Triacsin C体内抑制弓形虫速殖子增殖效果的检测及对靶动物主要脏器病理损伤研究120只昆明雌鼠随机分配为12组,每组10只。1-7组每只小鼠腹腔感染2×105RH株弓形虫速殖子。1-5组为实验组,8-12组为对照组,Triacsin C的剂量分别按照 0 ug/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL 每天灌胃 0.1mL服用1次,连用3天。6、7组,磺胺甲恶唑和阿奇霉素分散片的剂量分别按照20 mg/mL、60 μg/mL每天灌胃0.1mL服用1次,连用3天。第7天,处死小鼠,收集腹水进行弓形虫速殖子计数,检测肝脏组织中速殖子的含量,并采集心、肝、脾、肺、肾和脑组织进行病理学组织观察。经弓形虫速殖子计数发现,对比注射0 μg/mL Triacsin C的小鼠腹水中速殖子的含量,注射10μg/mL Triacsin C抑制速殖子增殖效果不显著(P>0.05),注射20μg/mL和40 μg/mL Triacsin C抑制速殖子增殖效果显著(P<0.05)。注射80 μg/mL Triacsin C、20 mg/mL SMZ和60 μg/mLAZM抑制速殖子增殖效果极显著(P<0.01)。经肝脏中速殖子含量计数发现,对比注射0 ug/mLTriacsin C的小鼠肝脏中速殖子的含量,注射10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL Triacsin C抑制速殖子增殖效果不显著(P>0.05),注射 80 μg/mL Triacsin C、20 mg/mL SMZ 和 60 μg/mL AZM 抑制速殖子增殖效果显著(P<0.05)。病理组织学观察对比给药组发现感染组小鼠的心脏、脑组织结构正常。不同药物浓度感染组组织结构损伤基本一致。感染组的小鼠肝细胞边界不明显,染色质边缘化,肝细胞出现肿胀,严重的表现为空泡变性、坏死;脾脏组织结构破坏,脾索排列紊乱,白髓区出血,有非血管组织,淋巴细胞核肿大、溶解,出现坏死;肺脏组织腔内有粘性物质出血,毛细血管扩张,粘膜下出现大量红细胞;肾脏结构破坏,近曲小管锥状细胞肿大,远端小管肾细胞脱落,蛋白液渗出,管腔内出现丝网状组织。给药组小鼠各个组织结构均正常。3.Triacsin C作用下对小鼠肝脏组织的转录组生物信息学分析本实验利用第二代测序技术(Next-Generation Sequencing,NGS)对感染组、感染给药组、给药组以及正常组小鼠肝脏组织转录组进行高通量测序并作出生物信息学分析。经Illumina测序结果显示:感染组、感染给药组、给药组和正常组分别获得了52079488±1161042、54630392±1161042、53578154±2685844、53769402±1173777条Raw reads。去除测序接头序列、低质量读段、N率较高序列及长度过短序列,最终获得高质量的测序数据clean data,感染组为52038760±1158903条,感染给药组为54588488±2686113条,给药组为53531310±1176376条,正常组为53712504±2070001条,分别占各自所在文库中原始数据的99.92%、99.92%、99.56%、99.89%。并且样品的Q20均高于95%,GC含量在47%～51%之间。感染给药组、感染组共有14412个差异表达基因,以感染组作为对照,感染给药组共有7518个基因表达上调,有6894个基因表达下调。显著差异表达的基因共77个,感染给药组相对于感染组显著上调和下调的基因数分别27个和50个。差异表达基因进行GO功能富集分析,发现差异基因表达显著富集于异戊二烯类生物合成过程、嘌呤核苷酸代谢过程、醇生物合成过程、二次醇生物合成过程、胆固醇生物合成过程、2’-5’-寡腺苷酸合成酶活性、配体门控钠通道活性、类固醇脱氢酶活性、氧化还原酶活性等生物学功能;Pathway富集分析,共获得代谢途径、视黄醇代谢、花生四烯酸、萜类骨架的生物合成等15个富集信号通路。