论文部分内容阅读
目的:M2型肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的渗透促进恶性肿瘤的恶性进展。然而,肿瘤细胞控制巨噬细胞募集和M2极化的机制在很大程度上尚不清楚。NADPH氧化酶4(NOX4)在非小细胞肺癌(NSCLC)中大量表达,并介导恶性肿瘤进展。NOX家族与肿瘤相关的炎症密切相关,然而,肿瘤NOX是否影响微环境巨噬细胞尚不明确。NOX4抑制剂GKT137831由于其低毒性,目前用于治疗特发性肺纤维化、糖尿病肾病、原发性胆源性胆管炎已进入临床试验,本研究将探究其用于非小细胞肺癌治疗的疗效,为扩展临床适应症提供依据。方法:(1)使用免疫组织化学染色法检测临床标本NOX4、CD206以及CD68的表达情况;(2)使用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测巨噬细胞IL-10、IL-12以及IL-23的表达情况以及磷酸化JNK(T183/Y185)、总JNK的水平,检测非小细胞肺癌细胞CCL7,IL8,CSF-1以及VEGF-C的表达情况;(3)使用免疫荧光技术检测细胞外过氧化氢的水平;(4)使用蛋白免疫印迹技术(Western blotting)检测非小细胞肺癌细胞NOX4、beta-Tubulin的表达情况,检测巨噬细胞CD206的表达情况;(5)使用NOX4质粒转染构建NOX4过表达细胞株,使用shRNA转染构建NOX4沉默细胞株;(6)MTT法检测非小细胞肺癌细胞的增殖能力;(7)给雌性BALB/c裸鼠皮下注射肿瘤细胞,得到异种移植皮下瘤;(8)使用流式细胞技术检测皮下瘤组织F4/80、CD206的表达情况。结果:(1)本研究使用TCGA RNA测序大数据进行分析发现,非小细胞肺癌患者中NOX4的表达与巨噬细胞趋化性之间存在密切关联;临床标本的免疫组织化学分析证实NOX4与CD68或CD206呈正相关;(2)非小细胞肺癌细胞(A549和Calu-1细胞系)中的NOX4有效增强小鼠腹膜巨噬细胞的迁移并诱导巨噬细胞M2型极化;(3)机制研究表明,肿瘤NOX4诱导产生的活性氧(ROS)通过PI3K/Akt信号依赖的方式刺激多种细胞因子的产生,包括CCL7,IL8,CSF-1和VEGF-C;使用NOX4抑制剂GKT137831处理细胞有效阻断NOX4过表达对CCL7,IL8,CSF-1和VEGF-C产生的影响;使用ROS清除剂NAC处理细胞的结果与GKT137831类似。(4)受肿瘤NOX4诱导的M2型巨噬细胞表现出JNK信号通路活性升高,表达和释放HB-EGF,从而促进非小细胞肺癌在体外的增殖;用JNK抑制剂预处理巨噬细胞可阻断受肿瘤NOX4诱导的M2型巨噬细胞中HB-EGF的产生;(5)在异种移植小鼠模型中,NOX4在A549细胞中的过度表达促进肿瘤的增殖;使用NOX4特异性抑制剂GKT137831抑制NOX4活性可抑制体内肿瘤增殖,同时减少巨噬细胞浸润,M2型巨噬细胞占总巨噬细胞的百分比降低。使用N-乙酰半胱氨酸(NAC)清除活性氧(ROS)的结果与GKT137831类似。结论:本研究表明,肿瘤NOX4通过ROS/PI3K信号传导依赖的多种细胞因子的产生来募集M2型肿瘤相关巨噬细胞,从而促进非小细胞肺癌细胞的增殖。GKT137831作为唯一进入临床试验的特异性NOX4抑制剂,具有应用于非小细胞肺癌治疗的潜在意义。