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目的：采用microRNA芯片比较肺腺癌细胞株(A549)和耐顺铂肺腺癌细胞株(A549/DDP)差异表达的miRNA,并对有意义的差异表达的miRNA进行荧光定量RT-PCR验证,筛选出肺腺癌耐药相关的miRNA。方法：常规培养A549及A549/DDP细胞株,Trizol法分别抽提两种细胞的总RNA,获得符合基因芯片杂交质控要求的RNA样品；对A549和A549/DDP细胞的小RNA分别进行Cy3和Cy5荧光标记,然后进行miRNA芯片杂交反应；采集芯片原始信号值并将图像信号转化为数字信号,将两芯片的信号值进行比对筛选出差异表达的miRNA;应用荧光定量RT-PCR方法对筛选出的miRNA进行可靠性验证,鉴定出肺腺癌耐药相关的miRNA。结果：miRNA芯片结果显示：与A549细胞相比,A549/DDP细胞中有12条miRNA存在2倍以上的表达差异,其中miR-1246、miR-1470、miR-638、miR-663、miR-181a、miR-1228*、miR-149*、miR-1908、miR-34a表达上调,miR-138、miR-224、miR-886表达下调；荧光定量RT-PCR对miR-138、miR-224、miR-638的检测结果与miRNA芯片结果方向一致,但miR-638不如miRNA芯片结果中明显,其CP值的差异较小。结论：多个miRNA在A549细胞和A549/DDP细胞之间存在差异表达,提示这些miRNA尤其是miR-138、miR-224可能与肺腺癌耐药相关。目的：利用瞬时转染技术上调A549/DDP耐药细胞株中miR-138和miR-224,观察它们转染后对A549/DDP细胞株细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡的影响。方法：采用化学方法合成miR-138和miR-224前体的寡核苷酸序列,构建pCDNA3.1-pri-miRNA重组质粒,以lipofeetamine2000瞬时转染A549/DDP细胞,实验分三组：空白质粒对照组、pri-miR-138转染组和pri-miR-224转染组。质粒转染24h后,三组细胞中均加入不同顺铂浓度药物进行处理(3.12μg/ml,6.25μ g/ml,12.5μ g/ml,25μ g/ml,50μ g/ml,100μ g/ml,200μ g/ml),48小时后通过MTT法检测各组细胞的存活率；质粒转染24h后,各组加入25μg/ml顺铂处理细胞48h后,采用P工染色法,流式细胞技术分析各组细胞周期分布；转染24h后,各组加入25μ g/ml顺铂处理细胞48h后,用标记了FITC的Annexin Ⅴ作为荧光探针,流式细胞技术分析各组细胞凋亡。结果：A549/DDP细胞转染后,MTT结果示在相同顺铂处理浓度下,pri-miR-138转染组细胞活力低于空白质粒对照组,两组工C50值分别为14.45和49.32,后者的耐药倍数约为前者的3.41倍,有显著差异(P<0.05)；pri-miR-224转染组的IC50约为40.93,miR-224转染后顺铂对细胞的存活率没有显著差异；流式细胞仪检测细胞周期示：pri-miR-138转染组G2期细胞占细胞总数的比例是12.02±1.4%,低于空白质粒对照组的25.75%±1.8%,有显著差异(P<0.05),转染pri-miR-138出现G2/M期缩短；而pri-miR-224转染组G2期细胞占细胞总数的比例是26.29±2.4%,与空白质粒对照组比较没有显著差异；流式细胞仪检测细胞凋亡示：pri-miR-138转染组凋亡率为34.09±1.2%,高于空白质粒对照组的13.47±0.7%,有显著差异(P<0.05),转染pri-miR-138后细胞凋亡率升高；pri-miR-224转染组凋亡率为19.19±1.5%,与空白质粒对照组没有显著差异。结论：A549/DDP细胞转染miR-138后,增强了顺铂对细胞活力的抑制作用,使细胞G2/M期缩短,同时促进了顺铂诱导的细胞凋亡,提示提高miR-138的表达水平能够使A549/DDP重新获得对化疗药物顺铂的敏感性。而miR-224的高表达对A549/DDP细胞的增殖、细胞周期以及顺铂诱导的细胞凋亡均无显著影响。目的：利用瞬时转染技术上调A549/DDP耐药细胞株中miR-138,在转录水平及蛋白水平上观察miR-138转染后对顺铂耐药相关基因的调控。方法：A549/DDP细胞转染72h后收集细胞,提取总RNA,通用引物逆转录出cDNA,以β-actin和GAPDH为内参照,对顺铂耐药相关基因MDRl、LRP、P53、Bcl-2、ERCC1进行半定量PCR扩增,分析A549/DDP细胞转染后细胞中这些基因的相对表达水平。同时用Western blot方法检测与顺铂耐药相关基因MDR1、LRP、P53、Bcl-2、ERCC1的蛋白表达量变化。结果：上调A549/DDP细胞中的miR-138后,RT-PCR结果示pri-miR-138转染组细胞中MDR1、LRP、P53、Bcl-2、ERCC1的基因mRNA表达量分别为0.767±0.053、0.477±0.102、0.739±0.084、0.978±0.071、0.822±0.068,与空白质粒对照组比较无显著差异；Western blot结果示pri-miR-138转染组细胞中ERCC1的基因蛋白表达量为0.431±0.025,明显低于空白质粒对照组细胞中ERCC1蛋白的表达,两者差异有显著性(P<0.05)；而miR-138转染组细胞中MDR1、LRP、P53、Bcl-2的基因蛋白表达量分别为0.881±0.066、0.381±0.087、0.756±0.044、0.893±0.033,与空白质粒对照组比较无显著差异。结论：miR-138在蛋白水平上下调ERCC1的表达,而在基因转录水平没有发生明显的调控作用,提示miR-138可通过调控ERCC1的蛋白表达,影响肺腺癌顺铂的耐药性。