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安丝菌素P-3（AP-3）是一种大环内酰胺类抗生素,属于I型聚酮,能够与微管蛋白的β亚基结合,阻碍微管组装,具有很强的抗肿瘤活性。目前对AP-3的高产研究主要是从发酵条件优化和代谢工程改造两个方面进行的,但是产量仍然很低。鉴于其重要的生物医药价值,提高AP-3的产量研究十分迫切。本文在前期研究的基础上,结合遗传改造与随机诱变育种实现了安丝菌素的产量提高。拟诺卡氏菌Nocardiopsis ansamitocini EGI80425是新分离的AP-3产生菌。我们首先测定了N.ansamitocini EGI80425的全基因组,分析了其基因组大小、存在形态等基本特征以及其中次级代谢基因簇的分布。其次,构建了N.ansamitocini EGI80425的遗传操作体系,并实施了对该菌株的遗传改造。通过优化菌丝体接合转移相关的培养时间、供受体数量、比例和培养基中Mg2+浓度等,最终在含有40 mmol/L Mg2+的ISP4培养基中,覆盖前培养20 h、受体数目为4×104 CFU、供体数量为1.2×107 CFU、受体/供体比例为1:300时,建立了效率为6.6×10-3的整合型载体pIB139的接合转移方法。由于自主复制型载体与整合型载体在受体细胞内的存在方式不同,因此就需要在整合型载体接合转移体系的基础上,对受体供体数量和比例进行优化。在供体大肠杆菌数量为1.2×107 CFU、受体数量为4×105 CFU、受体/供体比例为1:30时,接合转移效率最高,建立了效率为6.2×10-4的游离型质粒pJTU1278的接合转移方法。在对N.ansamitocini EGI80425次级代谢基因簇的分析中发现,基因组中存在另外3个聚酮生物合成基因簇。利用游离型质粒对有转录活性的潜在的PKS竞争基因簇Cluster I和Cluster VII进行了缺失。结果显示,Cluster I缺失突变株CXY01中AP-3的产量为12.6 mg/L,相比野生型提高了95.3%;Cluster VII缺失突变株CXY02中AP-3产量为7.4 mg/L,相比野生型提高了15.2%。除了利用遗传改造的手段,本研究还采用了常压室温等离子体诱变的育种方法。这是一种新兴的诱变育种方法,操作安全温和、环境友好、突变率高、获得的突变体性状稳定。在确定了A.pretiosum ATCC31280的致死率曲线之后,我们建立了常压室温等离子体诱变体系,接着在摇瓶发酵条件的基础上优化确立了24深孔板25oC、180 rpm的发酵条件,然后利用指示菌线黑粉酵母Filobasidium uniguttulatum对不同浓度AP-3的敏感性建立了从头添加AP-3的高通量筛选体系。最终配合利用这三个体系筛选出经过等离子体照射后发生稳定突变且AP-3产量提高的突变株,经过重测序找到发生突变的SNV及INDEL位点,初步解析了产量变化的原因。综上所述,本论文建立了N.ansamitocini EGI80425的遗传操作体系,并在此基础上对该菌进行了基因组片段敲除,有效提升了安丝菌素产量。除此以外,还结合了常压室温等离子体诱变,筛选到了产量提高菌株,为大量产生安丝菌素奠定了基础。