研究背景:胆囊癌(gallbladder cancer,GBC)作为胆道系统中常见的恶性肿瘤,发病率位居消化道恶性肿瘤的第7位,恶性程度极高,病程进展快,预后很差,患者的5年生存率仅在10%左右。目前来说,胆囊癌治疗的最佳方案仍然是肿瘤根治性切除,但根治切除术后的5年生存率也仅为16.5%左右,且术后也易复发和转移。而且由于胆囊癌具有发病隐匿且缺乏相应特异性的临床症状和早期诊断指标的特性,大多数胆囊癌患者在确诊时已经处于晚期阶段,已发生局部广泛浸润或者远端转移,这种情况下的患者就失去了根治性手术治疗的机会。另外放疗、化疗等辅助性治疗对中、晚期胆囊癌治疗效果也十分有限,即使是敏感性较高的吉西他滨,其治疗的有效性也仅为36%。因而通过研究相关机制优化现有治疗手段,或寻找新的作用靶点显得极为迫切。UBR5是一种果蝇抑癌基因。哺乳动物UBR5是HECT结构域家族(同源E6相关蛋白在羧基末端)E3泛素连接酶识别正降解决定子。人类UBR5基因具有59个外显子,编码约10kb的mRNA和>300kDa的蛋白质,在各种细胞类型中广泛表达。UBR5在多细胞动物中高度保守,具有独特的结构特征,并参与调控DNA损伤反应,代谢,转录和凋亡。因此,UBR5是与肿瘤生物学广泛领域相关的细胞信号传导的关键调控者。近年大量研究发现,UBR5在许多肿瘤的发生发展中均发挥着重要作用,UBR5表达异常极有可能与恶性肿瘤的增殖和转移过程都密切相关。另外,还有研究表明,UBR5可能还与一些癌细胞的耐药性或对化疗药的敏感性等相关,但其具体机制尚不十分明确。然而相对来说,目前UBR5在胆囊癌中的研究还比较少,所以探明其对胆囊癌的影响和相关机制,填补此研究区域上的空缺是十分必要的。目的:观察UBR5基因在胆囊癌组织中的表达高低,结合病例的临床信息,分析影响UBR5蛋白表达的危险因素以及研究影响患者预后的危险因素,再运用脂质体法对人胆囊癌细胞系GBC-SD中的UBR5基因进行沉默,然后研究其对细胞增殖能力的影响,以及细胞周期和细胞凋亡情况变化。方法:1、收集天津市南开医院2014年01月至2017年10月手术切除的胆囊癌标本39例,并购买胆囊组织芯片,共计79例病例资料,所有的病例术前均未接受过任何治疗,且都有完整的病例资料以及随访结果。全部标本组织皆是常规石蜡包埋切片,运用免疫组化技术检测标本中UBR5蛋白的表达强度。用卡方检验统计分析病例资料与UBR5蛋白表达高低的相关性。2、用慢病毒将shRNA转染到人胆囊癌GBC-SD细胞中使UBR5基因沉默,构建稳定低表达UBR5蛋白的胆囊癌GBC-SD细胞株。3、分别采用半定量PCR技术和蛋白印迹(Western blotting)方法检测基因沉默后胆囊癌细胞中UBR5基因的mRNA水平和蛋白水平,并且运用流式细胞技术检测UBR5基因沉默对胆囊癌GBC-SD细胞周期及凋亡情况的影响。结果:1、UBR5表达高低影响肿瘤生长的大小、肿瘤组织学类型和分化程度(p<0.05),而与年龄、性别、远处转移、淋巴结转移、临床分期以及Nevin分期无显著性差异(p>0.05)。其中还对患者进行了生存分析,UBR5表达高低、远处转移、分化程度与患者预后密切相关(p<0.05)。2、构建出稳定敲低的sh-UBR5-GBC-SD细胞株,绿色荧光蛋白的表达达到90%以上,且经半定量PCR技术和蛋白印迹(Western blotting)方法检测出sh1-UBR5-GBC-SD细胞株中UBR5蛋白表达最低。3、与乱序对照转染组SH0相比,UBR5基因敲低后胆囊癌细胞的生长速度也明显降低,细胞周期被阻滞于G2/M期,G1/G0期比例减小,S期的比例变化不大,细胞凋亡率明显升高,表明UBR5基因敲出在体外能抑制GBC-SD细胞生长。结论:1、UBR5在胆囊癌组织中表达较高时,患者的肿瘤较大、腺癌较多且恶性程度较高;UBR5表达水平较高的患者,其生存期较UBR5低表达患者短。2、本课题组构建出稳定低表达UBR5蛋白的GBC-SD细胞株,并筛选出胆囊癌GBC-SD-SH1细胞敲低效率最高。3、在人胆囊癌GBC-SD细胞中,UBR5低表达抑制细胞的生长,诱导细胞的凋亡,调控细胞周期,其具体机制有待进一步研究,本实验为UBR5基因对人胆囊癌细胞的影响和作用提供了最基本和必须的证据。